[发明专利]HAV检测

说明书

提供了用于检测生物样品中的HAV的方法，包括在反应混合物中扩增包含HAV的序列的靶核酸。该反应混合物包括可能含有靶核酸的生物样品和寡核苷酸组。本发明还提供了用于检测HAV的试剂盒。

本发明涉及利用寡核苷酸检测HAV的方法，寡核苷酸用于检测HAV的反应混合物和应用，以及包含用于检测HAV的寡核苷酸的试剂盒。

HAV(甲型肝炎病毒)是一种分类为肝病毒属的RNA病毒，其能导致肝炎，一种急性肝感染。HAV一般通过粪途径传播，通过摄取污染的食物或水或者通过与感染的人直接接触而在人与人之间传播。

甲肝有一个大约4周的潜伏期。病毒在肝中复制。在临床症状发作之前，潜伏期期间粪便中相对大量的病毒脱落，并出现短暂的病毒血症。疾病的严重性范围从无症状到无黄疸或者黄疸肝炎。当在细胞培养中生长时，该病毒是非引起细胞病变的。它的体内致病性，其涉及实质细胞坏死和组织细胞门静脉周围炎症，可通过细胞免疫应答介导。到症状发作的时间，粪便中病毒的分泌下降，可能已经停止，而且抗HAVIgM滴度增加。可以1到2周以后检测抗HAVIgG并持续多年。HAV基因组包含大约7500个核苷(nt)的正义RNA，其在3’末端聚腺苷酸化，而且具有与5’端连接的多肽(VPg)。一个大的开放式阅读框(ORF)占据了基因组的大部分，并编码理论分子量为M_r252,000的多聚蛋白。HAV多聚蛋白进行加工以产生结构(位于氨基末端)和非结构病毒多肽。已经从原型肠道病毒和鼻病毒，尤其是1型脊髓灰质炎病毒的研究中推断出了细小核糖核酸病毒的许多复制特征。

甲型肝炎病毒通过摄取和肠感染进入体内。然后病毒可能通过血流扩散到靶器官-肝。潜伏期期间，粪便中可以检测到大量病毒颗粒，从早到暴露之后10-14天开始，并一般持续到血清转氨酶的峰值高度。在疾病的急性阶段早期也在粪便中检测到病毒，但是临床黄疸发作以后相对不频繁。有趣的是，在潜伏期晚期也可以检测到持续存在的甲型肝炎病毒的抗体，这与肝损伤的生化证据发作大约一致。实验转移到黑猩猩以后，已经通过免疫荧光法把甲肝抗原定位于肝细胞的细胞质中。静脉接种以后，在肝以外的任何组织都没有发现该抗原。

各种血清学试验都可用于甲肝，包括免疫电子显微镜检查，补体结合，免疫粘连血凝试验，放射免疫分析和酶免疫分析。免疫粘连血凝试验，其已经广泛使用，是中度特异性和灵敏的。已经描述了几种放射免疫分析方法；其中，一种固相分析类型是非常方便的，很灵敏和特异性的。非常灵敏的酶免疫分析技术广泛应用。在用甲肝的MS-1株实验感染的志愿者中，在不同地理区域中肝炎不同爆发的患者中，以及在甲肝的随机案例中，只鉴定到了一种甲型肝炎病毒的血清型。在组织培养物中分离病毒需要延长适应作用，因此不适于诊断。

分子生物技术，例如基于病毒RNA的反转录和通过PCR进行扩增的那些技术，允许从任何种类的临床或环境样品检测非常小量的病毒RNA。可以通过本发明中提供的核酸检测方法检测HAV感染。

概述

本发明提供了检测生物样品中的HAV的方法，包括在反应混合物中扩增靶核酸，该靶核酸包含HAV的核酸序列。该反应混合物可包含生物样品和至少第一和第二引物，该生物样品可含有靶核酸，其中第一引物的核酸序列选自SEQ ID NO：5-8，第二引物的核酸序列选自选自SEQ ID NO：10-11。扩增产生了能被检测的扩增的靶核酸。

此外本发明提供了在扩增期间或之后检测扩增的靶核酸的方法。该方法也可包含反应混合物，该反应混合物进一步包含用于检测扩增的靶核酸的探针。探针的核酸序列选自SEQ ID NO：13-14。

还提供了这样的方法，其中在不含有HAV的单独小瓶中，在相同的循环条件下，和在包含相同比例的扩增试剂的反应混合物中，与HAV平行检测第二靶核酸。