[发明专利]一种源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，涉及一种源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl及其制备方法和应用。

背景技术

随着化学除草技术的迅速发展，除草剂的应用日益广泛，给农业生产带来了极大的经济效益。有机磷除草剂草甘膦是高效、低毒、灭生性苗后除草剂，近年来随着栽培耕作方式趋向于规模化和集约化，对农药草甘膦的需求量显著增加。近年来，草甘膦销售量以每年增加15％，多年连续占据世界农药销售额的第一位。

草甘膦的杀草原理是它能抑制芳族氨基酸的合成，从而导致杂草死亡。草甘膦阻止芳族氨基酸合成的具体部位是抑制5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶（EPSPS）。常规作物的EPSPS对草甘膦很敏感，如果直接接触，草甘膦会杀死常规作物。将编码降解草甘膦的蛋白或草甘膦低敏感的EPSPS转化到作物中，明显提高作物抗草甘膦除草剂的能力，2005年统计显示美国87%大豆，61%棉花和26%玉米为抗草甘膦转基因植物。

目前至少有两类功能不同的抗除草剂基因应用于转基因作物上。第一类是通过降低植物酶对除草剂的敏感性，进而减少除草剂对植物的杀伤能力。例如AroA的突变基因合成的5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的脯氨酸被丝氨酸所取代，酶活力不受影响，但是对非选择性除草剂草甘膦的结合力只有原来的25%，从而使植物对除草剂表现不敏感。第二类则是通过解除除草剂对植物酶的抑制实现对除草剂抗性。例如Bar基因，能合成乙酰转移酶，解除选择性除草剂草胺膦对植物谷氨酰胺酶的抑制，避免植物细胞因为氨的积累而死亡。常用的抗除草剂基因包括EPSPS基因（产生5-烯醇式丙酮酸莽草酸-3-磷酸合酶，抗草甘磷）、GOX基因（产生草甘膦氧化酶，降解草甘膦）、bar基因（产生草胺膦乙酰转移酶，抗草胺膦）、BXN基因（产生溴苯腈水解酶，抗溴苯腈）等。

EPSP合成酶广泛存在于自然界中，目前从不同植物中和微生物中筛选到很多类型的EPSP合成酶基因，但是大多数EPSP合成酶对草甘膦敏感，通过突变可以使EPSP合成酶对草甘膦敏感性降低，然而它与磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）的亲和力也随之降低，从而导致酶活力下降，如来源于大肠杆菌的EPSPS基因，通过T42M；G96A；T97I；P101L，P101T，和A183T位点突变，均能降低该酶对草甘膦敏感性，但相对酶活力也随之下降，因而尚不能商业化。主要的耐草甘膦作物（商品名叫Roundup Ready作物）含有从微生物转化到作物中的CP4EPSPS基因。该基因来源于农杆菌CP4菌株（Agrobacterium sp.strain CP4）。CP4EPSPS属于II型EPSPS，有不同于植物EPSPS基因的核苷酸顺序，转录翻译后的EPSP合成酶对草甘膦不再敏感，因而具有对草甘膦的耐药性，其催化活性介于植物和大肠杆菌之间。研究表明，第100位的丙氨酸在该酶感受草甘膦中起很大作用，将该位点突变为谷氨酸，对草甘膦敏感性恢复。有些耐草甘膦玉米含有被改变了的并来自玉米的EPSPS基因，由这个改变了的基因转录翻译后的EPSPS合成酶对草甘膦也不敏感，所以对草甘膦也有耐药性，但是这些基因表达的蛋白活性不强，必须通过超量表达来弥补。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种源于豌豆根瘤菌（Rhizobium legum inosarum）的EPSP合酶基因及其制备方法和应用，具体利用基因合成方法对源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因（AroA）进行改造获得可在植物中持续表达的EPSP合酶基因（AroA-Rl），该AroA-Rl基因编码的EPSP合酶具有草甘膦的抗性，转化到植物后能够提高植物对草甘膦除草剂的抗性。

为了达到上述目的，本发明的技术方案如下：

一种源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl，其核苷酸序列如SEQ ID No1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID No2所示。

一种源于豌豆根瘤菌的EPSP合酶基因AroA-Rl的制备方法，具体为：将来源于豌豆根瘤菌中的EPSP合酶基因（AroA）按照植物偏爱密码进行改造，利用PTDS基因合成法【Xiong et al.,Nucl Acids Res,2004,32:e98】，设计引物RLAROAI-1～RLAROAI-34进行PCR扩增合成本发明的EPSP合酶基因（AroA-Rl），其中设计引物RLAROAI-1～RLAROAI-34的具体序列如下：

1.RLAROAI-1:

GGATCCATGC TGAATGGTTC TGCTTCTAAG CCAGCTACTG CTCGTAAGTC TGCTGGTCTG