[发明专利]转基因动物的制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种高效、简便的制备转基因动物的方法，具体为利用胞浆DNA注射法结合piggyBac转座系统介导基因整合技术制备转基因动物的方法。

背景技术

制备转基因动物的效率及操作难度主要由两个方面决定：一是制备转基因动物时采用的显微操作技术，目前常用的主要包括原核显微注射、胞浆单精注射、体细胞克隆；二是制备转基因动物时用于介导外源基因整合的方法，目前常用的主要包括普通线性化质粒介导、病毒载体介导、转座系统载体介导。

对于某些哺乳动物(如猪、牛)，其原核包裹着脂滴，在显微镜下难以观察到清晰的原核，若通过理化处理进行原核观察，如对受精卵进行离心，使胞浆的脂肪颗粒沉积在一边，这不但增加了操作步骤，而且会对受精卵的发育能力造成较大的负作用。以制备转基因猪为例，一般情况下，原核显微注射法制备转基因猪的效率约为1％(转基因猪数/移植的注射胚胎数)。胞浆单精注射法和体细胞克隆法虽然也常用于制备转基因动物，但用这两种方法制备转基因动物的效率普遍也比较低。此外，用体细胞克隆法生产的转基因动物通常存在各种各样的发育缺陷，较多难以健康存活到成年。

人们一直希望尝试另一种途径：胞浆DNA注射法，通过胞浆注射基因获得转基因动物。胞浆DNA注射法由于不需对受精卵离心即可进行DNA注射，并且胞浆的空间比雄原核大得多，注射时所需的操作精细度和难度相对较小，所以，从操作上来说，胞浆DNA注射法比原核显微注射法更简便。

此外，转基因动物的制备效率还受所采用的介导外源基因整合方法的影响。在早期的制备转基因动物的研究中，外源基因一般是通过线性化的普通质粒介导整合，具体操作是将携带外源基因的线性化普通质粒注射到受精卵的雄原核，或在体细胞核移植前转染供体细胞，或在胞浆单精注射前与破膜的精子共孵育。这种介导外源基因的整合方法虽然简单，但外源基因在宿主基因组的整合效率通常很低，一般只有等宿主基因组发生断裂修复时才会被动地整合到宿主基因组中。而利用病毒载体或转座系统载体介导外源基因整合时，由于它们采用的是主动整合的机制，它们介导外源基因在宿主基因组的整合效率比普通线性化载体显著提高。但在这两种高效的介导外源基因整合的载体中，病毒载体携带的外源基因长度远小于转座系统载体，并且其引起的生物安全风险较大，所以转座系统载体较病毒载体更优越更安全。而在目前常用的转座系统载体中，曾有研究报道piggyBac转座系统介导的基因整合效率优于其它的转座系统(包括Sleeping Beauty(SB)、Tol2和Mosl等)。

本发明将胞浆DNA注射法与piggyBac转座系统介导的基因整合技术有效结合，建立起一种高效、简便的制备转基因动物的方法。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术之不足，提供一种转基因动物的制备方法。

本发明所采取的技术方案是：

转基因动物的制备方法，包括以下步骤：

1)将携带有外源基因的piggyBac转座子系统质粒通过胞浆注射法注入卵母细胞、体外受精卵或体内受精卵；

2)将注射后得到的胚胎移植至受体母体，产出表达外源基因的转基因动物。

优选的，步骤1)，将携带有外源基因的piggyBac转座子系统质粒与piggyBac转座酶表达质粒共同通过胞浆注射法注入卵母细胞、体外受精卵或体内受精卵。

优选的，piggyBac转座子系统质粒的浓度为10ng/μL～50ng/μL。

优选的，piggyBac转座酶表达质粒的浓度为piggyBac转座子系统质粒的0.5～2倍。

优选的，piggyBac转座酶表达质粒的浓度为piggyBac转座子系统质粒的2倍。

优选的，步骤1)中，体外受精完成后16～18h，对受精卵进行胞浆注射；或人工授精后，收集受精卵，在授精后24～28h对其进行胞浆注射。

优选的，步骤1)，在倒置显微镜上，用注射针引入piggyBac转座子系统质粒，或piggyBac转座子系统质粒与piggyBac转座酶表达质粒，将注射针移入操作液液滴内，固定卵母细胞或体外受精卵或体内受精卵，使其第一极体处于视野12点钟或者6点钟位置，注射针在3点钟部位与透明带接触后推动注射针，当针穿透卵质膜后，控制注射针将DNA注入胞浆内。

优选的，注射体积为10pL。

优选的，步骤2)，将注射后培养16～20h获得的胚胎移植至受体母体。

优选的，所述转基因动物为猪。

本发明的有益效果是：