[发明专利]一种从河流水体快速筛选异养型氨氧化微生物的方法

说明书

技术领域：

本发明属于环保技术领域，具体涉及一种从河流水体筛选异养氨氧化微生物的方法。 

背景技术：

氮元素循环是地球元素循环的主要途径之一。当含氮污染物被分解后，将进入氮循环的第一步核心环节：氨氧化过程。传统理论认为氨氧化过程主要由自养型微生物驱动，有机物的存在将严重抑制该过程的进行，导致河流氮污染情况的加剧。近年来，随着人们对湖泊氮循环系统的深入研究，逐渐认识到自养型好氧氨氧化过程并不是唯一驱动氨氧化的途径。异养型氨氧化可以实现有机物降解与氨氧化的同时发生，因此在河流碳氮污染非常普遍的今天显得尤其重要。异养型氨氧化的基本原理是异养型氨氧化微生物在好氧条件下同时转化氨氮、有机物为氮气与二氧化碳等，以达到同时降解河流中氨氮与有机物的功能，与传统的自养型生物脱氮技术相比具有节能降耗和环境友好等突出优点。 

由于以往对河流异养氨氧化过程的忽视，导致其微生物功能大大被低估。应用异养氨氧化技术的一个关键前提就是研发筛选方法。从自然界河流等水体筛选的土著异养氨氧化微生物具有安全性、环境友好性与经济性的优点。但是由于自然界水体微生物众多，因此需要一个转性的筛选过程以达到快速筛选异养型氨氧化微生物的目的。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种快速、大量从自然水体获取异养型氨氧化微生物的从河流水体快速筛选异养型氨氧化微生物的方法。 

本发明的从河流水体快速筛选异养型氨氧化微生物的方法，其特征在于，包括以下步骤： 

a、取河流表层水体，经过隔除和沉淀后，再用灭菌的0.22微米滤膜抽滤，滤膜放入瓶中进行预培养，培养基为抽滤后的河水或者人工培养液，培养温度为25～35℃，振荡培养3～4天，维持pH值6～7，溶解氧高于2mg/L，得到预培养液；所述的人工培养液，其碳氮比20～30：1，碳源为葡萄糖、乙酸、柠檬酸、乳酸、蔗糖、丙酸和甲酸中的一种或数种的组合物； 

b、从预培养液取出液体，分离纯化富集培养液体中的微生物； 

c、异养氨氧化活性实验：采用专性液体培养基对步骤（b）分离纯化富集培养的微生物进行氨氮降解活性测定，挑选在培养2-3天后氨氮降解效率60%以上的微生物，由此得到高效菌株； 

d、对步骤（c）获得的高效菌株进行再分离纯化富集培养，由此得到异养型氨氧化微生物。 

所述的步骤（a）人工培养液优选为M1液体培养基，其每升在1L抽滤灭菌后河水中加入NH₄Cl 0.1g，葡萄糖0.5g、乙酸钠0.5、乳酸钠0.25、柠檬酸钠0.25g、蔗糖0.25g，COD控制在500mg/L，pH6-7之间。 

所述的步骤（c）的专性液体培养基为M3液体培养基，其每升是这么配制的：在1L水中加入NH₄Cl 0.1g，葡萄糖0.5g，NaHCO₃ 0.2g，KH₂PO₄ 0.1g，CaCl₂·2H₂O 0.04g，MgSO₄·7H₂O 0.0.82g，KCl 0.04g，NaCl 0.04g，再用NaHCO₃调节pH到7左右。 

所述的步骤（b）和步骤（c）的分离纯化富集培养，其具体步骤优选为：采用稀释法对微生物稀释后，涂平板进行分离，涂布平板的营养培养基为M2固体培养基，经培养后，采用平板划线分离，划线平板的营养培养基为M1固体培养基，再经培养后，完成对微生物的分离纯化富集培养； 

所述的M1固体液体培养基，每升是这么配制的：在1L抽滤灭菌后河水中加入NH₄Cl 0.1g、葡萄糖0.5g、乙酸钠0.5、乳酸钠0.25、柠檬酸钠0.25g、蔗糖0.25g和琼脂20g，COD控制在500mg/L，pH6-7之间； 

所述的M2固体培养基，每升是这么配制的：在1L水中加入NH₄Cl 0.1g，葡萄糖0.5g，NaHCO₃ 0.2g，KH₂PO₄ 0.1g，CaCl₂·2H₂O 0.04g、MgSO₄·7H₂O 0.0.82g和琼脂20g。