[发明专利]一种利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法

权利要求书

1.一种利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法，其特征在于：将携带含有石油烃降解基因和遗传选择标记的广宿主自转移降解质粒的宿主菌接种到待处理的污染土壤中，并添加营养液，通过微生物间的接合转移作用，使广宿主自转移质粒所携带的降解基因发挥高效降解作用，进而达到持久修复石油烃污染土壤的目的。

2.按权利要求1所述的利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法，其特征在于：

所述营养液成分为：(NH₄)₂SO₄0.5g/L，NaNO₃0.5g/L，MgSO₄7H₂O0.2g/L，KH₂PO₄1.0g/L和NaH₂PO₄H₂O l.0g/L；营养液的添加量为100-150ml/kg干土。

3.按权利要求1所述的利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法，其特征在于：

所述遗传选择标记为：抗生素抗性基因、β-半乳糖苷酶基因（lacZ）或绿色荧光蛋白基因（gfp）。

4.按权利要求1所述的利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法，其特征在于：所述石油烃降解基因为：编码芳香环羟化双加氧酶基因（phdA）、甲苯单加氧酶基因（touA）、编码苯双加氧酶基因（ben）、编码甲苯双加氧酶基因（tod）中一种或几种。

5.按权利要求1所述的利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法，其特征在于：所述宿主菌为染色体带有利福霉素抗性（Rif^R）选择标记的变形菌（Proteobacteria）α-,β-或γ-任一亚纲中的菌株。

6.按权利要求5所述的利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法，其特征在于：所述宿主菌为根瘤农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）C58（利福平抗性）、恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida）UWC1（利福平抗性)或钩虫贪铜菌（Cupriavidus necator）JMP228（利福平抗性)。

7.按权利要求1所述的利用广宿主自转移降解质粒对石油污染土壤进行生物修复的方法，其特征在于：

1）宿主菌活化和扩大培养：将保存于甘油管的携带广宿主自转移质粒的宿主菌接种到含相应双选择标记（宿主菌的选择标记和质粒的选择标记）的LB固体培养基上进行菌株活化，活化后再接种于LB液体培养中，振荡培养至菌液的菌体密度达5.0×10⁶CFU/mL；将上述培养好的菌液按5%体积接种量接种到LB液体培养基进行扩大培养，培养至1.0×10⁹CFU/mL；

2）菌剂制备和接种：将上述发酵液离心，采用无菌水洗涤菌体，并调整菌液浓度至1.0×10⁸CFU/mL，而后将菌液按10⁵-10⁶CFU/g干土的接菌量接种到石油烃污染的土壤中，再添加营养液，调整含水量为15%-20%，培养时间为2-18周；进而达到持久修复石油烃污染土壤的目的；营养液的添加量为100-150ml/kg干土。