[发明专利]贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法

权利要求书

1.贝酵母耐硫杂交育种后代的鉴定方法，包括以下步骤：

    （1）贝酵母杂交：参照Codon等（1995）的方法进行；

    （2）贝酵母菌株耐硫性测定：

将不同菌株接种于新鲜的含15 mg/L 亚硫酸钠的YPD(pH 3.5，含琥珀酸盐)上，能长起来的为耐硫菌株，不能长起来的为非耐硫菌株；

    （3）提取和纯化贝酵母DNA：

将菌种采用划线法接种到新的培养基上，获得单菌落；接种单菌落酵母到10mL酵母试管培养基中(YPD培养基)，28℃，培养18h；取1.5mL酵母培养液,12000r/min离心1min收集菌体,加入600μL山梨醇buffer,5μL10U/μL溶菌酶(Lyticase),30℃处理30min；4000r/min离心10min,沉淀中加入200μL缓冲液GA重悬,加入20μL蛋白酶K混匀,加入4μL RNaseA(100mg/mL),室温放置5min；加入220μL缓冲液GB,颠倒混匀,70℃放置10min,加220μL 无水乙醇充分颠倒混匀,所得溶液和沉淀都加入吸附柱中,12000r/min离心30s,向吸附管中加入500μL缓冲液GD,12000r/min离心30s,向吸附柱中加入500μL漂洗液PW洗两次,最后加入30μLddH₂O洗脱柱子上的酵母基因组DNA；

（4）组成PCR反应体系（单位：微升）配方：

                     2.5 微升 10×PCR buffer (包含 Mg²⁺),

                     1 微升的 10 mM 前导链引物

                     1 微升的 10 mM 后导链引物 

                     0.5 微升的10 mM of each dNTP

                     0.2 微升的5U/μL Taq DNA 聚合酶

                     2 微升 模板DNA

                     17.8微升  dH₂O

      上述PCR反应体系以FZF1为基因扩增引物：L1: TAC GGG TTG ACC ACT CCA AT；R1: CAC CGC GTT CAT ATC ATC AG；

（5）PCR反应程序：①95℃5分钟；②95℃解链30钞；③60℃退火30秒；④72℃延伸60秒；⑤②-④35个循环；⑥72℃延伸7分钟；

（6）PCR产物用凝胶成像系统观察结果：经1.2%琼脂糖凝胶电泳，该琼脂糖凝胶含0.5 μg·mL^-1的溴化乙锭，电压为3～5 V/cm，照像记录；

   （7）PCR产物测序：获得的序列用Vector NTI软件转化成FASTA格式，并用BLAST与NBCI数据库中的序列进行比对，鉴定结果：耐硫亲本只产生一条大小为1020bp的条带；而非耐硫亲本为一条700bp的条带。

2.根据权利要求1所述的鉴定方法，其特征是进一步以FZF1为基因扩增引物PCR分析筛选杂交后代，结果所筛选杂交后代特征突出，均表现为两条带。

3.根据权利要求1或2所述的鉴定方法，其特征是进一步用ISSR区分属于不同菌株的耐硫杂交后代：

（1）组成PCR反应体系配方：

2.5μL 10×PCR buffer (包含 Mg²⁺),

                      2μL的10 mM 引物，

                      0.5μL的10 mM dNTP，

                    0.2μL的5U/μL Taq DNA 聚合酶，

                     2μL 模板DNA，

                    12.8μL ddH₂O；

ISSR引物如下：

（2）PCR反应程序为：①95℃5分钟；②95℃解链30秒；③56℃退火30秒；④72℃延伸60秒；⑤②-④40个循环；⑥72℃延伸7分钟；

（3）PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，该琼脂糖凝胶含0.5 μg·mL^-1的溴化乙锭，电压为3～5 V/cm，用凝胶成像系统观察结果，并照像记录；

在鉴定结果中，不同单菌落如同属一菌株则ISSR图谱一致，如分属不同菌株则ISSR图谱不一致。