[发明专利]一种高温木聚糖酶和一种高温木糖苷酶的基因及其蛋白表达和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和生物质利用领域，具体涉及一种高温木聚糖酶基因和一种高温木糖苷酶基因及其蛋白表达与应用。

背景技术：

半纤维素是自然界中数量最大、最重要的可再生利用的生物质之一。木聚糖是半纤维素中最主要的组分。木聚糖结构复杂，主链由通过β-1,4-糖苷键连接的吡喃木糖组成，并包含葡萄糖醛酸基、乙酰基，α-L-呋喃型阿拉伯糖基等侧链。木聚糖及其酶解产物在食品、饮料、饲料、医药、化工、服装和造纸等领域具有广泛应用价值（M.Polizeli,A.Rizzatti,R.Monti et al.2005）。尽管天然木聚糖的酶解得到广泛的重视，但酶协同作用低、稳定性差等因素仍然限制了其应用。本发明涉及的高温厌氧菌C.owensensis OL能够在高温环境下高效利用天然半纤维素为碳源（S.Blumer-Schuette,D.Lewis,R.Kelly et al.2010）。本发明从C.owensensis OL中获得β-1,4-木聚糖酶和β-1,4-木糖苷酶基因，并在进行大量重组表达。β-1,4-木聚糖酶能够具有在高温条件下（75℃）将天然半纤维素转化低聚木糖，β-1,4-木聚糖酶和β-1,4-木糖苷酶能够协同作用将天然木聚糖完全转化成木糖。

发明内容

发明目的：

本发明的目的是弥补现有木聚糖降解技术的不足，提供一种高温木聚糖酶和一种高温木糖苷酶的基因，包含基因的重组载体和重组工程菌，以及两种酶的蛋白表达和应用。具体包括如下：

1、一种高温β-1,4-木聚糖酶Co Xylanase A的基因，其基因序列如SEQ ID NO.1所示，其表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2、一种高温β-1,4-木糖苷酶Co Xylosidase A的基因，其基因序列如SEQ ID NO.3所示，其表达的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3、本发明提供包含上述木聚糖酶基因的重组载体pET-28b-XylanaseA和包含上述木糖苷酶基因的重组载体pET-28b-XylosidaseA。

4、本发明提供包含上述木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A基因及重组载体的重组菌，所述菌株为大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）。

5、本发明提供制备上述木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A表达和纯化的方法。

6、本发明提供上述高温木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A在酶解天然木聚糖和木质纤维素原料上的单独和协同应用，优选其在水解榉木木聚糖及其在制备低聚木糖和木糖中的应用。

技术方案：

为实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

（1）高温木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A基因重组载体和重组工程菌的构建。

提取热解纤维素菌C.owensensis的基因组，设计引物分别PCR扩增木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A的基因，再酶切连接到载体pET-28b上，转化大肠杆菌Top10感受态细胞，筛选并通过测序鉴定阳性重组载体，提取重组载体质粒，转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，获得还有重组载体的重组工程菌。

（2）上述高温木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A的蛋白纯化和酶学活性测定。

将获得的重组工程菌转接培养，IPTG诱导酶蛋白表达。通过超声波破碎细胞，高速离心和Ni-NTA sepharose4B亲和层析分离纯化；然后通过SDS-PAGE电泳和分子筛鉴定蛋白分子大小和聚合态，其中高温木聚糖酶Co Xylanase A以单体形式存在，高温木糖苷酶Co Xylosidase A存在单体和聚体形式；最后浓缩，测定蛋白浓度，分析蛋白的酶学性质。

（3）上述高温木聚糖酶Co Xylanase A和木糖苷酶Co Xylosidase A对天然木聚糖的应用。