[发明专利]一种快速构建高表达稳定性细胞株的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，具体涉及一种快速构建高表达、稳定的细胞株的方法。

背景技术

在大规模生产生物制品中，构建良好的、高表达的及稳定的细胞株是关系到大规模细胞培养工艺的放大和成功的关键。

目前，国际最常用的细胞表达系统为CHO（中国仓鼠卵巢细胞）细胞。如龙沙（lonza）公司的GS表达系统，主要是利用转载质粒含有谷氨酰胺合成酶及目标基因的共同表达，在缺陷（没有谷氨酰胺）培养基的选择下，筛选出高表达的细胞。其优点是快速（仅需4个月）筛选出的细胞表达量高（2-4g/L）。另一个常用的表达系统为DHFR（二氢叶酸还原酶）缺陷型选择系统。细胞宿主为CHO-DHFR缺陷型，培养基中必须加入GHT（核酸前体）才可以存活生长。筛选的主要原则是通过主要是转载质粒含有DHFR及目标基因的共同表达，在缺陷（没有GHT）培养基的选择下，筛选出高表达的细胞。虽然DHFR系统得以广泛使用.但细胞表达量有很大的范围，例如0.5g/L到4g/L不等。产生差异的原因，除了目标基因的因素外，

高表达的转载质粒是主要因素。许多公司通过增加增强子（如安进的Ease）及和隔离子(如Millipore)来增加启动子的活力。

相比之下，国内尚未具备构建高表达和稳定的生产细胞株的技术关键及经验，构造出的细胞株基本在1g/L,无法进行工艺放大及产业化，主要通过购买国外的现有细胞株及服务来解决，从而也导致我国大规模细胞培养工艺面临巨大瓶颈。

发明内容

本发明的目的是针对以上要解决的技术问题，提供一种能够快速构建高表达的、稳定的细胞株的方法。

本发明的目的是这样实现的：

为了获取高表达的细胞株，高活力的启动子是关键。比较常用的方法是在表达盒的前或后面加入增强子，转录激活子会结合到增强子的位置，大大提高启动子的活力，从而获得高表达的目标基因的细胞株。

Gal4上游激活序列(UAS，Upsteam activating sequence)是调节目标基因表达的非常有利的工具之一。它通过酵母Gal4转录因子，可以结合到UAS cis-调节位点来激活目标基因的表达。VP16是一个已知的疱疹表达蛋白，可以提高启动子的活力。

本发明的技术关键是构建一个表达Gal4DNA结合位点和VP16启动子激活位点融合蛋白的转载质粒，另外构建一个目标基因的转载质粒。在目标基因转载质粒的启动子前构建5个UAS cis-调节位点，同时把Gal4-VP16融合蛋白转载质粒及UAS-启动子-目标基因的转载质粒同时转入宿主细胞中，Gal4-VP16蛋白会结合到UAS cis-调节位点，VP-16可以大大提高启动子的活力，从而获得高表达的目标基因。

Gal4-VP16融合蛋白上游激活序列（UAS）是一个已被充分研究的表达系统.本发明利用该表达系统的特点，将其应用于构建高表达和稳定的生产细胞株。

由此可见，本发明是对UAS-Gal4-VP16基因调节表达系统在构建高表达和稳定的生产细胞株方面的应用。

本发明提供的快速构建高表达稳定性细胞株的方法步骤如下：

（1）构建Gal4-VP16融合蛋白的表达载体质粒，在Gal4及VP16之间加入大T抗原核定位信号；

（2）构建UAS-目标基因蛋白的表达载体质粒，在该UAS-目标基因蛋白的表达载体质粒的启动子前构建5个UAS cis-调节位点，；

（3）采用IRES连接目标基因及DHFR基因，将上述Gal4-VP16融合蛋白的表达载体质粒及UAS-启动子-目标基因的表达载体质粒同时转导入宿主细胞中；

（4）选择筛选目标基因的稳定表达细胞株；

（5）扩增；

（6）获得高表达稳定细胞株。

根据本发明提供的方法，所述宿主细胞为DHFR-CHO细胞（二氢叶酸还原酶缺陷型-中国仓鼠卵巢细胞）。

根据本发明提供的方法，所述步骤（1）中所述Gal4-VP16融合蛋白的表达载体质粒上含有博来霉素的表达基因，所述步骤（2）中所述UAS-目标基因蛋白的表达载体质粒上含有新霉素的表达基因，所述步骤（4）中用含有新霉素、博来霉素和缺失GHT的培养基进行选择筛选。

根据本发明提供的方法，所述步骤（5）中用甲氨蝶呤进行扩增。