[发明专利]一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种乙型肝炎病毒检测试剂盒，具体涉及一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒。

背景技术

乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后所引起的疾病。乙型肝炎病毒是一种嗜肝病毒，主要存在于肝细胞内并损害肝细胞，引起肝细胞炎症、坏死、纤维化。乙型病毒性肝炎分急性和慢性两种。急性乙型肝炎在成年人中90%可自愈，而慢性乙型肝炎表现不一，分为慢性乙肝携带者、慢性活动性乙型肝炎、乙肝肝硬化等。全球约20亿人曾感染过HBV，其中3.5亿人为慢性感染者，每年约有100万人死于HBV感染所致肝衰竭、肝硬化和原发性肝癌（HCC）。我国是病毒性肝炎的高发地区，乙肝病毒携带率为总人数的10%左右，每年新发病人约900万人。目前，依据核苷酸序列异源性≥8%或S基因序列异质性≥4%可将HBV DNA分为A～I共9个基因型。HBV基因型的分布具有一定的地理流行病学特征，通过研究不同地区优势基因型可以反映出该地区HBV自然感染史发生的变异特点，这是由病毒变异后进化所导致的结果。在中国的HBV基因型是以B、C和D这3型为优势基因型，并以C型最多。

不同HBV基因型可以导致不同的临床表现及预后。有研究表明基因D型HBV感染者更易发生肝衰竭，且基因D型更易引起慢性乙型肝炎病情的复发；基因B型感染者较C型感染者较少发生肝损害，且基因B型感染者较C型不易发展至肝硬化、炎症程度较轻、HBeAg血清学转换更早。基因C型感染者其肝脏炎症坏死评分高于基因B型感染者。另有研究显示，基因C型HBV感染者较B型感染者更易发展为肝硬化和肝癌（HCC）。此外，C型较之B型更易发生核心启动子（BCP）区域的变异，可能导致临床上表现为HBeAg阴性的慢性乙型肝炎。

不同基因型HBV感染对抗病毒的反应不同。HBV感染对于扰素治疗的有效性在病毒分子学方面的因素仍有许多是未知的。干扰素治疗的费用昂贵，需注射，并且有较多不良反应以致患者较难耐受。因此在临床上预测干扰素治疗的有效性是非常重要的。目前普遍认为，在HBeAg阳性慢性乙肝患者中，基因B型患者对于干扰素的应答率高于基因C型患者，且在HBeAg清除方面基因B型高于基因C型。目前，在欧洲肝病协会最新版本的HBV防治指南里已经明确指出，在经干扰素治疗后，A型与B型有着比C型与D型更高的应答率。

因此，HBV基因分型检测可以在乙型肝炎患者的临床类型、预后判断及治疗方法的选择等方面发挥重要的作用。

目前HBV基因分型的主要实验诊断技术是基于核酸检测的分子生物方法。主要有全基因测序分析、线性探针反向杂交、限制性片段长度多态性分析（RFLP）、基因芯片、反向斑点杂交以及荧光PCR法等。测序技术虽然结果可靠准确，但是由于其技术复杂、实验流程长、实验条件要求高、耗时长和费用昂贵难以用作临床常规使用；RFLP技术相对简单，但是酶切位点易受基因变异的影响，且遇混合感染或酶切不完全，会出现复杂条带，影响分型结果的判断；其它杂交、芯片类等需要对PCR产物进行分析的方法相对来说均存在较易污染的弊端。荧光PCR技术是基于传统PCR技术并结合光谱技术而发展起来的一种更灵敏，更特异，更精确的核酸检测技术。检测结果准确，重复性高，特异性好，且整个过程中避免了传统PCR需后处理的问题，减少了污染。

结合国内情况，在HBV基因分型的实验诊断中，实时荧光PCR技术凭借着快速、敏感、特异等优点显示出了其临床诊断的优越性，目前已有多家荧光PCR诊断试剂盒在临床HBV基因分型诊断中常规使用，但是缺乏完善的质控体系，还需要进一步完善和提高技术水平，使此类产品更加满足临床准确诊断的需要。

运用PCR技术进行检测主要涉及到两个方面，核酸的提取和核酸的扩增检测。

目前国内临床上主要采用煮沸法对乙型肝炎病毒的核酸进行提取：先将分泌物样本浓缩、洗涤，再加裂解液，煮沸，高速离心，取上清为模板。对于浓缩这一步，不同厂家的浓缩效果不一样，有的可以看到沉淀，有的无法看到，看得到沉淀的是因为将病毒与蛋白都浓缩了，这样，导致后面加入裂解液时很难充分混匀；无法看到沉淀，使操作者无法确定吸弃上清时会不会吹打到病毒核酸。