[发明专利]聚乙二醇化的组织激肽释放酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及聚乙二醇修饰的蛋白类药物，特别是聚乙二醇修饰的组织激肽释放酶及其制备方法和其在药物制备中的应用。

背景技术

激肽释放酶，又称激肽原酶（kininogenase）或血管舒缓素（kallidinogenase），它是属于丝氨酸蛋白酶的一种，存在于各种组织和生物液体中，催化大分子前体物（激肽原，Kininogen）释放生物活性肽（激肽，Kinin）。激肽释放酶的生理效应包括使毛细血管和动脉血管舒张以及通透性增加，使冠状动脉、脑、视网膜处的血流供应增加，适用于高血压冠状血管以及动脉血管硬化等症，对心绞痛、血管痉挛、血栓性闭塞性脉管炎、冻疮以及创伤等症也有治疗作用。同时，激肽释放酶也可以作为活化因子，使纤溶酶原激活成纤溶酶，将不溶性的纤维蛋白水解成可溶性的小肽，从而对脑梗塞、动脉粥样硬化等起到治疗作用，并用于治疗血栓、预防血栓再形成（G.M.Yousef,E.P.Diamandis Clin Biochem,2003(36):443-452）。体外研究显示，激肽释放酶对离体动脉具有舒张作用，并可抑制血小板聚集、增强血细胞变形能力和氧解离能力。动物试验显示，激肽释放酶静脉注射可增加麻醉犬椎间、颈总和股动脉血流量，增加麻醉犬后肢、家兔肌肉血流量。因此，激肽原酶在人类微循环障碍（如糖尿病肾病或糖尿病眼底病变等）及轻-中度急性血栓性脑梗死等疾病的治疗中具有较高的应用价值。

国内市场上现有的激肽释放酶药物分为两类：一类是从猪胰脏中提取的组织激肽释放酶，它来源广泛，但是免疫原性较高，不适于静脉给药；另一类是从新鲜人尿中提取精制的人尿激肽原酶，虽然其不存在免疫原性问题，但是原料限制较大，产量较低。此外，二者均存在半衰期短，需反复重复给药的问题。为克服此类药用蛋白和多肽普遍存在的生物稳定性差、体内半衰期短和具免疫原性等缺点，通常采用基因工程改造和化学修饰等手段对其进行修饰改造，提高药用蛋白和多肽的体内生物稳定性，延长半衰期，降低或消除免疫原性。但针对每种蛋白的结构特殊性，对各类方法的适用及其产生的实际效果却有很大的差距。

聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)是一种常用的蛋白质修饰剂，可有效延长蛋白质类生物药物的半衰期并降低免疫原性。PEG修饰类型分为随机修饰和定点修饰。随机修饰是在蛋白质赖氨酸的ε氨基上进行的修饰反应，该类型PEG修饰剂反应迅速，修饰率高，但是修饰产物比较复杂，单修饰产物的位点不均一，修饰产物活性各不相同，难以保证批次间的稳定性。定点修饰主要包括N末端修饰和半胱氨酸残基修饰，两种修饰手段均可保证样品的一致性，但是对蛋白质的结构和性质要求较高。并且，在大多数情况下，与未修饰的原蛋白相比，聚乙二醇化的蛋白药物的活性会降低，一般修饰后的蛋白活性仅有原蛋白的30%-40%,甚至更低。例如Schering-Plough公司的PEG-Intron,是用分子量为5000的PEG修饰干扰素，修饰后其活性只有原蛋白的8%。并且，随着PEG分子量的增大，修饰后的蛋白质活性降低更明显。例如用分子量为20KDa、30KDa、40KDa的PEG修饰促红细胞生成素（EPO）后，活性随着PEG分子量的增大而显著减小(Yin-jue Wang,journal of controlled release,2010(145):306-313)。由此可见，蛋白的结构以及所用PEG的分子量以及修饰的位点等对聚乙二醇化的蛋白质的生物活性有很大的影响。对于特定药物的修饰，聚乙二醇修饰剂是影响修饰产物理化性质、体内外生物活性、药代动力学、药效学以及修饰产物临床表现最重要的因素。

激肽原酶的PEG化修饰目前国外没有相关的报道研究，而国内只有中国药科大学的吴梧桐老师做过初步研究（聚乙二醇（PEG5000）对胰激肽释放酶化学修饰的初步研究，药物生物技术，2006（13）：409-412）。采用分子量为5000的以琥珀酰亚胺碳酸酯为活性基团的PEG对激肽原酶进行氨基随机修饰，所得产物均一性较差，并且稳定性不高，极易发生水解，半衰期及免疫原性均未得到明显改善。因此为了开发出长效的、低免疫原性的，并且具有较高生物活性的聚乙二醇化的激肽原酶需要选择更加合适的修饰方法和PEG原料。

发明内容

解决的技术问题：本发明旨在提供一种具有高的生物活性、长半衰期、低免疫原性的聚乙二醇化的组织激肽释放酶(KLK1)，及其在制备治疗轻-中度急性血栓性脑梗死疾病的药物中的应用。更进一步的说：

本发明的第一目的是提供一种聚乙二醇化的KLK1；

本发明的第二目的是提供一种上述的聚乙二醇化的KLK1的制备方法；