[发明专利]一种抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法

权利要求书

1.一种抑制金黄色葡萄球菌毒力因子的方法，包括药物干预作用、试剂配制、测量总蛋白浓度、SDS-PAGE电泳和测定溶血毒素的表达，其特征在于，具体步骤如下，

（1）药物干预作用，将复壮后的金黄色葡萄球菌接种至3ml含0.5%葡萄糖的TSB液体培养基中，35~37℃、250rpm/min培养12h后，接种到300mlTSB液体培养基中放大培养，培养至OD₆₀₀=0.3分成N份，分别加入黄芩苷和黄芩素，加入黄芩苷的浓度为0~1/2MIC，加入黄芩素的浓度为0~1/2MIC，置于35~37℃、250rpm/min培养5h后取样，12000rpm/min离心5min，分离菌体和上清液，上清液用0.22μm滤膜过滤，备用；

（2）试剂配制，配制10%过硫酸铵、12%的分离胶、浓缩胶、封闭液和显影定影液；

（3）测量总蛋白浓度，取10μl 5mg/ml牛血清白蛋白用TSB液体培养基稀释至100μl，后按0、1、2、4、8、12、16、20μl分别加到96孔板，加入TSB液体培养基将体积补足至20μl，再取20μl步骤（1）获得的上清液，加入到上述各孔中，后各孔加入200μlBradford染色液，震荡混匀5min用酶标仪测定A₅₉₅，根据标准品测得数值绘制标准曲线，再根据标准曲线计算出上清液的总蛋白浓度；

（4）SDS-PAGE电泳，包括制备凝胶、电泳上样、转膜、封闭、孵育抗体、发光显影定影和凝胶图像分析；

（5）测定溶血毒素的表达，

1）引物设计，包括上游引物和下游引物；

2）提取RNA，将步骤（1）获得菌体加入0.5mlDEPC水漂洗，10000rpm/min转离心1min，取上清液加入60μl 10mg/ml溶菌酶、5μl溶葡萄菌酶及TE buffer后震荡重悬细菌，置于35~37℃、40min裂解菌壁后， 4℃、12000rpm/min离心3min，得沉淀液；加入1mlTrizol均质化5min，再加入200μl氯仿摇15s，混匀放置3min后，4℃、12000rpm/min离心15min；将上层水相移至新的EP管中，加入480μl异丙醇，混匀后置于-20℃ 20min，4℃、12000rpm/min离心15min得沉淀，弃上清液；EP管加入1ml75%酒精，摇晃使沉淀溶解，4℃、12000rpm/min离心10min得沉淀，室温晾干；加入RNase-free水溶解，测RNA浓度；

3）RNA逆转录，以2μg步骤2）获得的RNA为模板，具体过程及反应体系如下：

试剂              用量

RNA               xμl

Oligo（dT）₁₈       1μl

DEPC水补至        12μl

第一步反应体系为12μl，反应条件为65℃ 5min，4℃ 5min；

试剂                    用量

40mg/L 5×反应缓冲液    4μl

20U/μl RNA酶抑制剂     1μl

10mMdNTP Mix          2μl

200U/μl逆转录酶         1μl

第一步欲结合完成后加入上述试剂，使得反转录体系总体积为20μl，第二步反应条件为42℃60min，70℃5min，最后降至4℃；即cDNA；

4）普通PCR验证，以cDNA为模板，进行普通PCR扩增，反应条件为95℃预热5min，94℃变性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，一共35个循环，最后72℃温育5min，取10μlPCR扩增产物，加至已加入Ⅰ型核酸染料的2%琼脂糖凝胶加样孔中，在TBE缓冲液中电压为100V进行电泳25min，凝胶成像系统下观察结果并拍照；普通PCR的反应体系如下：

 2×Taq PCR Master Mix            12.5μl

灭菌去离子水                    9.5μl

上游引物                        1μl

下游引物                        1μl

cDNA                           1μl

总计                            25μl

5）mRNA水平定量检测，荧光定量PCR试剂盒进行反应液配制，反应液配制在冰上进行，实时定量PCR仪进行扩增反应，荧光定量PCR的反应条件：95℃预变性10min，95℃变性15s，58℃退火60s，40个循环，在每个循环延伸阶段读取荧光信号，最后生成扩增曲线、产物溶解曲线；反应体系如下：

2×Taq PCR Master Mix          12.5μl

灭菌去离子水                   9.5μl

上游引物                       1μl

下游引物                       1μl

cDNA                         1μl

总计                          25μl。