[发明专利]兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1在制备诊断或检测兔脑炎微孢子虫感染试剂中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种诊断或检测兔脑炎微孢子虫感染的方法，特别涉及一种以兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1作为抗原，利用ELISA方法诊断或检测兔脑炎微孢子虫的方法，以期提高诊断的敏感性，本发明属于兽类的疾病诊断技术领域。

背景技术

兔脑炎微抱子虫病是由兔脑炎微孢子虫（又名兔脑炎原虫，Encephalitozoon cuniculi）引起的1种慢性、隐性或亚临床人畜共患的原虫病。兔脑炎原虫具有广泛的宿主，包括无脊椎动物、啮齿类动物、兔形动物、草食动物、肉食动物和灵长类动物等，已报道的有兔、大鼠、小鼠、豚鼠、野鼠、家犬、牛、狐狸、猪、貂及昆虫（蝉）等，其中家兔的感染率最高，可达76%。人类亦可感染。多数动物通常为隐住感染而不表现临床症状，但可作为传染源而传播疾病，有的可引发致命性疾病。

本病广泛分布于世界各地，我国亦有发生本病的报道。近年来，出现了大量有关兔脑炎微抱子虫引起艾滋病患者致死性临床感染的报道，致使该人畜共患病受到医学界的广泛关注和高度重视。

动物最容易被侵害的器官是中枢神经和肾脏。对于食肉动物来说，微孢子虫病是新生动物的一种严重神经性疾病，也是圈养狐狸地方性流行病，能够造成很大的经济损失。

圈养的狐狸可能通过摄取污染鼠类尿液或者粪便的食物以及垂直传播获得感染。因本病的血清学检测是活体动物或者人类重要的诊断方法，因为通常情况下不可能通过组织学进行检测，而且检测尿液或者粪便病原体敏感性很低。目前已经发表的血清学诊断方法有直接凝集实验，间接免疫荧光和酶联免疫吸附实验。

其中酶联免疫吸附试验主要是以细胞培养的虫体破碎后作为抗原的ELISA。但是虫体培养成本很高，而且虫体生长缓慢，纯化虫体和抗原制备过程费力。

也有文献报道使用大肠杆菌表达的重组PTP2蛋白或者PTP3蛋白作为诊断抗原但是PTP2蛋白是该虫体极管蛋白，利用重组PTP2蛋白的特异性和敏感性还有待检验。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种以更敏感的重组蛋白作为抗原，利用ELISA方法检测或诊断兔脑炎微孢子虫病的方法，以期提高诊断的敏感性。

为了达到上述目的，本发明采用的技术手段为：

本发明根据NCBI数据库发表的兔脑炎微孢子虫SWP1基因序列设计特异性引物，在感染微孢子的狐狸肾脏样品中，扩增出SWP1基因的部分序列（21位氨基酸到终止密码子），通过序列测定分析基因序列。同GB-M1的SWP1序列相比，本发明所扩增得到的SWP1序列有一段重复序列的缺失（序列已提交到Genebank，序列号为KF169728），扩增得到的SWP1序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

将融合表达的SWP1-GST用于样品的检测。结果表明该融合表达的SWP1-GST蛋白对于检测兔脑炎微孢子虫感染的狐狸血清具有良好的特异性，但与弓形虫，新孢子虫，隐孢子虫阳性血清没有交叉反应。而且结果显示SWP1蛋白的敏感性明显高于PTP2蛋白。

故本发明申请人提出了兔脑炎微孢子虫（Encephalitozoon cuniculi）孢壁蛋白SWP1在制备诊断或检测兔脑炎微孢子虫感染试剂中的应用。

在本发明中，优选的，所述的兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1为与GST融合表达的重组蛋白SWP1-GST，其中兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

在本发明中，优选的，所述的兔脑炎微孢子虫孢壁蛋白SWP1与GST融合表达的重组蛋白SWP1-GST通过以下方法制备得到：

（1）根据NCBI数据库发表的兔脑炎微孢子虫SWP1基因序列设计特异性引物，在感染兔脑炎微孢子虫的狐狸肾脏样品中，扩增出编码SEQ ID NO.1所示的孢壁蛋白SWP1的核苷酸序列，或通过序列合成的方法直接合成编码SEQ ID NO.1所示的孢壁蛋白SWP1的核苷酸序列；

（2）从PGEX-4T1载体上扩增GST标签序列，并将其插入到PcoldIII载体的NdeI位点中，然后将所扩增或合成得到的SWP1基因序列插入到pColdIII原核表达载体的XhoI和EcoRI位点之间，与GST标签进行融合表达，用GST纯化树脂纯化，即得SWP1-GST。

更优选的，所述的编码SEQ ID NO.1所示的孢壁蛋白SWP1的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。