[发明专利]在昆虫细胞sf9中表达hABCG2的方法在审
| 申请号： | 201310751320.6 | 申请日： | 2013-12-31 |
| 公开（公告）号： | CN104745632A | 公开（公告）日： | 2015-07-01 |
| 发明（设计）人： | 谢伟胜;张科之 | 申请（专利权）人： | 苏州杰诺曼博生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12N15/866 | 分类号： | C12N15/866;C12N15/12;C07K14/47 |
| 代理公司： | 南京苏科专利代理有限责任公司 32102 | 代理人： | 陆明耀;姚姣阳 |
| 地址： | 215123 江苏省苏州市苏州工*** | 国省代码： | 江苏;32 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 昆虫 细胞 sf9 表达 habcg2 方法 | ||
1.一种在昆虫细胞sf9中表达人hABCG2的方法，其特征在于包括如下步骤:
步骤一，人工合成两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的hABCG2基因；
步骤二，将hABCG2基因克隆入pFastBac1载体的BamHI/HindIII位点，得到重组质粒pFastBac1-hABCG2；
步骤三，将重组质粒pFastBac1-hABCG2转化DH10Bac大肠杆菌感受态细胞，与其中的杆状病毒穿梭载体Bacmid重组，获得插入hABCG2基因的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCG2；
步骤四，脂质体介导重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCG2转染sf9昆虫细胞，获高滴度的hABCG2的重组病毒；
步骤五，hABCG2的重组病毒感染SF9昆虫细胞，大量表达hABCG2蛋白。
2.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达hABCG2的方法，其特征在于：步骤一所述的两端分别包含BamHI和HindIII酶切位点的人hABCG2基因通过如下方法获得：根据NCBI参考序列信息NM_004827.2，在5‘端添加BamHI酶切位点序列，在3’端添加HindIII酶切位点序列，序列总长度为2343bp。
3.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达hABCG2的方法，其特征在于：还包含对所述重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCG2的鉴定方法。
4.根据权利要求3所述的在昆虫细胞sf9中表达hABCG2的方法，其特征在于：所述的重组杆状病毒穿梭载体Bacmid-hABCG2的鉴定方法采用PCR鉴定，步骤如下：
分别以T-pFast F:(SEQ ID No.1 )和T-pFast R:(SEQ ID No.2)、T-hABCG2 F:(SEQ ID No.3)和T-hABCG2 R:(SEQ ID No.4)、或/和T-pFast F:(SEQ ID No.1 )和T-hABCG2 R:(SEQ ID No.4)为引物组合对SF9-hABCG2基因组DNA进行PCR扩增，扩增出对应的2659bp、376bp、995bp目标片段，即为hABCG2基因在SF9昆虫细胞中表达完成。
5.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达hABCG2的方法，其特征在于：还包括重组hABCG2蛋白功能的鉴定方法，步骤如下：
将ABCG2蛋白的转运底物加入表达ABCG2蛋白的细胞膜中，加入ATP/AMP反应，反应终止后将细胞膜中微囊泡外面的转运底物洗去，通过液质联用、荧光测定法或同位素标记底物法中的一种方法来测定微囊泡内的转运底物浓度，从而判定ABCG2蛋白的活性。
6.根据权利要求5所述的在昆虫细胞sf9中表达hABCG2的方法，其特征在于：所述微囊泡内的转运底物浓度越大，ABCG2的活性越高。
7.根据权利要求1所述的在昆虫细胞sf9中表达hABCG2的方法，其特征在于：所述的重组病毒培养基为无血清无抗生素的昆虫细胞培养基。
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