[发明专利]利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法

权利要求书

1.一种利用CRISPR/Cas9系统构建真核基因敲除文库的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）构建稳定表达OCT1蛋白和Cas9蛋白的真核细胞系：将编码蛋白OCT1和Cas9的DNA序列通过柔性Linker连接，然后克隆至慢病毒载体pOCT1-2A-Cas9-IRES-BSD上；用构建好的载体转染真核宿主细胞；筛选稳定表达OCT1蛋白和Cas9蛋白的真核细胞系；其中，载体pOCT1-2A-Cas9-IRES-BSD的序列如SEQ ID No.1所示；

2）sgRNA质粒文库的构建：

i.根据sgRNA作用位点的DNA序列5’-G-Nx-NGG-3’，其中19≤x≤22，设计并合成针对上述作用位点的sgRNA单体，针对同一个sgRNA作用位点设计两个sgRNA单体，其序列分别为正向单体：5’-ACCG-Nx-3’，反向单体：5’-AAAC-N’x-3’，其中N’x为Nx的反向互补序列，N和N’表示碱基A、T、G或C；

ii.将上述合成的针对同一个sgRNA作用位点的两个sgRNA单体退火形成具有粘性末端的双链DNA，并将针对所有基因合成的sgRNA单体经退火形成的双链DNA等量混合；

iii.将人U6启动子连接ccdB序列以及序列5’-G-Nx-NGG-3’之后，连入PLL3.7载体中替换原载体上的U6启动子，将构建好的载体与ii中得到的混合物混合，加入BsmBI限制性内切酶和T4连接酶，37℃ 5min，16℃ 5min，重复10个循环；

iv.将上述产物转化至Trans1-T1感受态细胞中，提取质粒，即构建得到sgRNA质粒文库；

3）将上述质粒文库中的质粒与质粒psPAX2和PMD2.G共转染至HEK293T细胞中，培养细胞，收获病毒液；

4）用收获的病毒液按MOI=0.05接种步骤1）中构建得到的真核细胞系，细胞经培养后，使用流式细胞仪分选带有绿色荧光的细胞，即获得真核基因敲除的细胞文库。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述真核宿主细胞包括但不限于HEK293T、HT1080、HeLa细胞。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1）中所述柔性Linker序列为p2A：5′-GGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCT-3′。

4.根据权利要求1-3任一项所述方法构建的真核基因敲除细胞文库。

5.一种研究基因功能的方法，其特征在于，基于权利要求4所述的细胞文库，提取细胞的基因组DNA，设计引物，PCR扩增含有sgRNA序列的DNA片段，利用深度测序技术对扩增产物进行测序，分析测序结果，从而确定sgRNA所对应基因的功能。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物序列为正向引物：5’-TATCTTGTGGAAAGGACGAAACACC-3’，反向引物：5’-AATACGGTTATCCACGCGGC-3’。