[发明专利]多核苷酸引物

说明书

本申请是国际申请PCT/GB2008/003306，国际申请日2008年9月29日，中国国家阶段申请号200880110038.7的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及多核苷酸、含有多核苷酸的试剂盒，以及在基因中检测突变存在与否的方法。

背景技术

磷酯酰肌醇3-激酶(PI3K)是参与细胞信号传递的一大类脂质激酶。PI3K-AKT途径在许多类肿瘤中被激活，导致细胞生长、增殖和存活异常(补充的1篇近期综述)。近来，在人癌症中鉴定出了1A型PI3K(PI3KCA)催化亚基中的突变[1]。这些突变在致癌作用中的确切作用仍然并没有被明确确定，但随着许多靶向PI3K抑制剂的开发，突变检测对于患者筛选来说变得日益重要。这些突变的检测中的技术难题来自于可能只包含少量突变序列的肿瘤活组织切片的限制。另外，从石蜡包埋组织提取的DNA常常已被降解且质量很差。测序检测所需要的突变DNA的最低水平是15-25%，因此对于开发能在异源样品中检测少量突变的等位基因的灵敏的检测法以及进行所述检测法所需的产品具有迫切的需求。

本发明试图满足该需求。

发明内容

本发明提供了对肿瘤引起的PIK3CA突变的灵敏耐用的检测法。

根据本发明的一个方面，提供了一种多核苷酸，其含有下列引物序列之一的至少最后6个核苷酸：SEQ.ID NO.3-16,18,20-33,35或37-39，或其互补序列。也就是说，所述多核苷酸含有下列引物序列之一3’末端的至少6个核苷酸：SEQ.ID NO.3-16,18,20-33,35或37-39，或其互补序列。

优选地，所述多核苷酸包含下列引物序列之一、或其互补序列、或与其具有80%、90%、95%或99%序列一致性的序列3’末端8、10、12、14、17、18或20个核苷酸或整个序列的至少75%的核苷酸：SEQ ID NO.3-16、18、20-33、35或37-39。

在本发明的一些实施方式中，提供了一种多核苷酸，其包含以下引物序列之一3’末端10个核苷酸的至少75%的核苷酸：SEQ.ID NO.3-16、18、20-33、35或37-39，或其互补序列。

通常，所述多核苷酸短于100个核苷酸，优选短于80个核苷酸，更优选短于60个核苷酸，更优选短于40个核苷酸，更优选短于30个核苷酸。

优选地，所述多核苷酸还含有淬灭基团和荧光团。

通常，所述淬灭基团和荧光团由含有第一和第二区域的核苷酸尾序列隔开，其中所述第一区域的核苷酸与第二区域的核苷酸互补但呈反向，从而所述第一区域与第二区域的杂交导致所述淬灭基团与所述荧光团足够靠近，以淬灭所述荧光团。

优选地，所述尾序列还含有第三区域，其具有与PIK3CA基因的一个区域互补的序列。

优选地，所述多核苷酸含有SEQ ID NO:18的3’末端的至少6个核苷酸，并且所述尾序列含有SEQ.ID NO.17。

或者，所述多核苷酸含有SEQ ID NO:35的3’末端至少最后的核苷酸，并且所述尾序列含有SEQ.ID NO.34。

或者，所述多核苷酸含有SEQ ID NO:39的3’末端至少最后的核苷酸，并且所述尾序列含有SEQ.ID NO.38。

通常，所述淬灭基团含有Dabcyl。

优选地，所述荧光团含有Hex,Fam或Rox。

根据本发明的另一个方面，提供了一种含有本发明的至少两种多核苷酸的试剂盒。

优选地，所述试剂盒含有包含SEQ ID NO.18的多核苷酸和包含SEQ ID NO.3-16之一的多核苷酸;或含有包含SEQ ID NO.35的多核苷酸和包含SEQ ID NO.20-33之一的多核苷酸;或含有包含SEQ ID NO.39的多核苷酸和包含SEQ ID NO.37的多核苷酸。

通常，所述试剂盒还含有核苷三磷酸，聚合酶和/或缓冲液。

根据本发明的另一个方面，提供了将本发明所述的多核苷酸或试剂盒，或含有SEQ.ID NO.3-16,18,20-33或35或其互补序列3’末端6个核苷酸中的4或5个的多核苷酸用于检测含有PIK3CA基因的至少一个片段的核酸样品中的突变的用途。