[发明专利]一种转导肽-dsRNA结合域融合蛋白及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种转导肽-dsRNA结合域融合蛋白及其应用。

背景技术

细胞转导肽是由4-30个富含精氨酸或赖氨酸构成的短肽，它具有穿透细胞膜的能力(Gautam et al.,2012;Lindgren,Llbrink,M.,A,& Langel,2000)，1988年转导肽Tat（trans activity transcript）首次于HIV病毒发现(Frankel&Pabo,1988)。细胞转导肽能转染包含生物大分子（分子量大于180kDa）(Funhoff et al.,2004)、多肽、质粒、纳米颗粒等穿透细胞膜及血脑屏障(Lindgren,Gallet,et al.,2000)等普通载体难以穿透的细胞膜。在过去的20多年的研究历程中，转导肽得到的较大的研究和应用，但是其的穿透膜的机制目前还不明确，主要包括以下3种可能机制：直接穿透细胞膜(Ter-Avetisyan et al.,2009)；细胞内吞作用(Fotin-Mleczek,Fischer,&Brock,2005;Richard et al.,2003)；以及巨胞饮(Jones&Sayers,2012)。

RNA干扰是由内源性或外源性的小分子RNA（siRNA，21-30nt）或长链dsRNA在Dicer酶的作用降解产生的siRNA介导的在RNA诱导沉默复合物等作用下与mRNA结合导致mRNA被降解，最终使目的基因沉默(Fire et al.,1998)。基于RNAi技术，设计特异目标基因的siRNA能特异性的介导目标基因的沉默，为肿瘤、心血管、神经系统及内分泌系统等疾病治疗提供了新方法，同时也为疾病的致病机制和机理的研究提供的途径。RNAi技术的临床应用首先要克服的是外源性siRNA转染到靶细胞或组织，由于siRNA带有高负电荷、高分子量等特征，siRNA的转染是目前限制siRNA被广泛应用的最大障碍。目前多种siRNA载体系统被开发，包括病毒载体（如腺病毒和逆转录病毒载体等）和非病毒载体（如脂质体、壳聚糖、纳米颗粒、转导肽及聚合物等等），但是由于毒副作用强、致癌性、免疫原性、缺乏靶向性转染、转染率低及稳定性差等等问题，siRNA载体的研发依然是任重道远。

基于转导肽的转导功能，它被应用于小分子干扰RNA（small interference RNA，siRNA）载体(Eguchi et al.,2001;Endoh&Ohtsuki,2009)，转导肽可以通过化学修饰siRNA携带siRNA进入细胞，或通过转导肽富含精氨酸或赖氨酸等阳性氨基酸显示强正电荷能与带强负电荷的siRNA结合从而引导siRNA进入细胞。研究中发现，带负电的siRNA极易与带正电的转导肽结合，产生siRNA/转导肽聚合体进一步聚集沉淀(Meade&Dowdy,2007)，或带负电的siRNA中和了转导肽的正电性，减弱或终止转导肽的细胞膜的穿透功能(Meade & Dowdy,2008;Veldhoen,Laufer,Trampe,&Restle,2006)，从而限制了其的在siRNA转导中的应用。

为了克服转导肽在siRNA转导中问题，本发明通过将双链RNA结合域（dsRNA binding domain,dsRBD）与转导肽（转导肽，Hph1）结合，其中dsRBD能高亲合力与siRNA结合，其后转导肽介导dsRBD-siRNA复合物穿透细胞膜，为了提高转导效率两个转导肽被加入到融合蛋白形成融合蛋白（Hph1-Hph1-dsRBD）。

发明内容

本发明的目的是为了克服转导肽在siRNA转导中问题，设计一种转导肽-dsRNA结合域融合蛋白，该融合蛋白能有效的结合siRNA并高效地转染siRNA到细胞诱发RNA干扰效应。

实现上述发明的技术解决方案是：一种转导肽-dsRNA结合域融合蛋白，该融合蛋白是由两个细胞膜穿透肽Hph1与dsRNA依赖的蛋白激酶(PKR)中的dsRNA结合域组成的，分子量为：18kD；该融合蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该融合蛋白的蛋白序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明公开了一种该蛋白的应用，该融合蛋白作为siRNA载体。