[发明专利]一种甘精胰岛素前体的复性方法

权利要求书

1.一种甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于包括如下步骤：将甘精胰岛素前体溶解于变性剂溶液中，得到溶液I；再加入还原剂进行还原，调节pH值为9.5～11.5，得到反应体系I；控制反应体系I的温度为35℃～45℃，反应30～60min，获得变性后的甘精胰岛素前体溶液；将变性后的甘精胰岛素前体溶液加入稀释缓冲液中，得到溶液II；向溶液II中加入蛋白质折叠添加剂，调节pH值为9.5～11.5；接着向得到的溶液中持续通入空气，得到反应体系II；控制反应体系II的温度为0℃～20℃，反应2～40小时，获得甘精胰岛素复性液；

所述的还原剂为二硫苏糖醇和半胱氨酸盐酸盐中的一种或两种；

所述的还原剂的用量为按还原剂与甘精胰岛素前体质量比1:2～1:4计算。

2.根据权利要求1所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于：

所述的溶液I中的甘精胰岛素前体的浓度为17～28g/L；

所述的溶液II中变性后的甘精胰岛素前体的终浓度为0.8～2.0g/L。

3.根据权利要求2所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于：所述的溶液II中变性后的甘精胰岛素前体的终浓度为1.0～1.4g/L。

4.根据权利要求1所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于：

所述的变性剂为尿素或盐酸胍；

所述的稀释缓冲液为三羟甲基氨基甲烷、甘氨酸、碳酸氢铵和磷酸盐中的一种制备得到的缓冲液；

所述的蛋白质折叠添加剂为聚乙二醇、甘油和金属离子中的至少一种。

5.根据权利要求4所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于：

所述的变性剂溶液为6～8M、pH 9.5～11.5的尿素溶液或盐酸胍溶液；

所述的稀释缓冲液为10～50mM、pH 9.5～11.5的Tris-HCl缓冲液或10～50mM、pH 9.5～11.5的甘氨酸缓冲液。

6.根据权利要求4所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于：

所述的聚乙二醇为PEG4000或PEG6000；

所述的金属离子为Ca²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺和Fe³⁺中的一种；

所述的蛋白质折叠添加剂为由终浓度为0.5～2g/L的聚乙二醇、体积百分比5%～20%的甘油和5～50µM的金属离子组成。

7.根据权利要求6所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于：所述的蛋白质折叠添加剂为由终浓度为0.5～2g/L的PEG4000、体积百分比5%～20%的甘油和5～20µM的Cu²⁺组成。

8.根据权利要求1所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于：所述的通入空气为将空气按每升溶液中以2～100cm³/H的速率向溶液中通入；

所述的反应体系II的反应条件为4～15℃反应12～25小时。

9.根据权利要求1～8任一项所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）甘精胰岛素的变性方法：将甘精胰岛素前体溶解于6～8M、pH 9.5～11.5的变性剂溶液中，得到溶液I；加入还原剂，调节pH值为9.5～11.5，得到反应体系I；其中还原剂与甘精胰岛素前体按质量比1:2～1:4配比，控制反应体系I的温度为35℃～45℃，反应30～60min，获得变性后的甘精胰岛素前体溶液；

（2）甘精胰岛素的复性方法：将变性后的甘精胰岛素前体溶液加入稀释缓冲液中，得到溶液II；向溶液II中加入聚乙二醇、甘油和金属离子，其中，聚乙二醇的终浓度为0.5～2g/L，甘油的终浓度为体积百分比5%～20%、金属离子的终浓度为5～50µM，调节pH值为9.5～11.5；接着向所得溶液中持续通入空气，得到反应体系II；控制反应体系II的温度0℃～20℃，反应2～40小时，获得甘精胰岛素复性液。

10.根据权利要求9所述的甘精胰岛素前体的复性方法，其特征在于：

步骤（1）中所述的溶液I中的甘精胰岛素前体的浓度为17～28g/L；

步骤（1）中所述的变性剂为尿素或盐酸胍；

步骤（1）中所述的还原剂为DTT和半胱氨酸盐酸盐中的一种或两种；

步骤（2）中所述的溶液II中变性后的甘精胰岛素前体的终浓度为1.0～1.4g/L；

所述稀释缓冲液为10～50mM、 pH 9.5～11.5的Tris-HCl缓冲液或10～50mM、pH 9.5～11.5的甘氨酸缓冲液；

所述的聚乙二醇为PEG4000；

步骤（2）中所述的金属离子为Cu²⁺，浓度为5～20µM；

步骤（2）中所述的通入空气为将空气按每升溶液中以2～100cm³/H的速率向溶液中通入；

步骤（2）中所述的反应体系II的反应温度为4～15℃；

步骤（2）中所述的反应体系II的反应时间为12～25小时。