[发明专利]一种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE及其应用。

背景技术

猪圆环病毒2型（porcine circovirus type2，PCV2）是断奶后仔猪系统消耗综合征（postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）、猪皮炎肾病综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）、仔猪先天性震颤及猪呼吸道疾病等的主要致病因素。PCV2属于圆环病毒科，是目前发现的最小的动物病毒。PCV2无囊膜，呈二十面对称体，直径约17nm，该病毒包含有11个开放读码框，其中0RF1和ORF2是2个最大的编码框。ORF1编码病毒的复制蛋白Rep和Rep，，这2种蛋白与病毒的复制密切相关。ORF2编码病毒的主要结构蛋白，该蛋白包含有病毒特异类型抗原表位，能够诱导保护性的免疫以抵抗PCV2的感染，因此衣壳蛋白（capsid protein，Cap）已经广泛用于血清学诊断及作为最佳的目的抗原来设计疫苗以抵抗PCV2相关疾病。目前，PCV2相关疾病仍然是养猪业中流行最为广泛的疾病之一，造成了巨大的经济损失。尽管目前已经有多种商品PCV2疫苗上市，这些疫苗在很大的程度上有效控的控制PCV2感染，但是PCV2相关疾病依然流行,因为这些疫苗并不能完全阻止PCV2的感染和传播。因此有必要研究更为有效的疫苗来控制PCV2相关疾病。

表位疫苗是以抗原上某些特定表位为基础制备的疫苗，主要包括表达自身蛋白的亚单位表位疫苗、合成肽疫苗、重组表位疫苗、表位核酸疫苗等。目前该种类型的疫苗已经成为研制感染性疾病、恶性肿瘤以及自身免疫性疾病等疫苗的新设计方向。为了克服由于抗原表位结构简单，分子量小，单独使用时免疫原性较弱，且在体内容易被降解，很难引起较强的免疫应答而获得长期的免疫效果的缺陷，本研究通过基因工程的方法将Stevenson等已鉴定的PCV2ORF1和ORF3上3个具有免疫优性的T细胞表位基因进行串联后与保护性抗原基因ORF2融合表达，期望融合表达蛋白能够有效刺激机体产生高水平中和抗体以及能够增强靶动物的体液免疫和细胞免疫水平。

细胞免疫调节在清除病毒感染过程中发挥了重要的作用,近年来，PCV2ORF1和ORF3的具有免疫显性的T细胞表位已经被鉴定。Stevenson等研究PCV2T细胞抗原表位（T lymphocyte epitope，TCE）时,采用合成线性的含有20aa的多肽，通过动物试验测定它们诱导外周血液单核细胞中T淋巴细胞的增殖能力，筛选获得了3个具有免疫优势的多肽片段，分别是由PCV2ORF1编码的2个多肽(第81～100位和201～220位氨基酸),由PCV2ORF3编码的另一个多肽(第31～50位氨基酸)。另外Stevenson等（2007）的研究还发现T淋巴细胞反应主要是针对PCV2的ORF1和ORF3基因编码的非结构蛋白。目前大量研究结果表明，具有保护性抗原基因与多表位基因融合具有协同作用，能诱导更好的体液免疫和细胞免疫。因此，如何构建具有良好免疫原性的T细胞表位基因表达载体，生产更有效的疫苗来控制PCV2相关疾病是一个亟需解决的问题。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，其是将PCV2的免疫原性蛋白基因ORF2与人工化学法合成的具有免疫显性的三个T细胞表位串联基因TCE（位于PCV2的ORF1基因81-100aa,201-220aa区域和位于PCV2的ORF3基因上31-50aa区域）融合连接后重组至腺病毒载体后获得，该重组腺病毒rAd-ORF2-TCE在提高T淋巴细胞增殖水平及特异性抗体表达的同时，还可以显著提高细胞因子IFN-γ、IL-2的含量，具有更好的免疫效果。

为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种重组腺病毒rAd-ORF2-TCE，其是将PCV2的免疫原性蛋白基因ORF2与TCE基因融合连接后重组至腺病毒载体获得的。

本发明首要的问题是阐明PCV-ORF2与TCE基因至腺病毒载体后的成功表达及其免疫学活性。因此，腺病毒穿梭载体的成功构建成为本研究是否成功的关键和前提条件。我们在总结前人研究的基础上，将重叠延伸PCR法将PCV-ORF2基因与TCE基因通过疏水甘氨酸接头进行PCR扩增融合，取得两个基因同时高效表达的效果。