[发明专利]一种用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法

说明书

技术领域

本发明属于生物标记技术领域，尤其涉及一种用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法。

背景技术

目前，细胞治疗（包括干细胞和免疫细胞）被广泛用于肿瘤、自身免疫病、移植等多个临床治疗领域。研究细胞在体内的迁移和分布，对于细胞治疗的临床应用和提升至关重要。现有的细胞标记方法，主要是通过荧光染料、抗体（免疫学荧光标记）、报告基因和荧光素等相关标记技术来研究细胞形态、细胞融合、细胞动力学、细胞迁移等细胞功能，并且一些技术需要结合组织病理学相关切片技术，在不同时间点将组织从动物中取出进行切片，染色标记，研究目标细胞在某个时间点在体内各种生理变化情况。然而这种标记细胞的方法却无法实现对活细胞在体内的实时跟踪，限制了靶细胞在活体内的研究。为解决传统示踪方法的不足，急需研究开发出能用于活体示踪的活细胞标记方法，采用这些方法可对同一实验对象在不同时间点进行比较，标记跟踪活细胞在体内的迁移及相关变化，所得的数据信息更加详尽。这明显减少了实验动物数量，同时又为细胞与医药研究领域提供了指导。而这种动态的活体示踪，需要开发出一种高效，稳定的活细胞标记技术来实现。

运用于活细胞的标记方法主要有：荧光染料标记，荧光素和荧光蛋白，普通量子点活细胞示踪以及一些光学成像等影像技术，但由于它们都有各自的缺陷，每种单一成像模式都不能提供完美的光学信号。其中，目前的量子点活细胞示踪技术，是通过细胞吞噬，或载体携带进入细胞，会对细胞的生理活性产生影响，不利于目标细胞研究。普通光学成像是运用生物发光剂（染料）和内源性荧光报告基因或者是运用外源性探针检测分子监测目标物的生化过程，但都有其固有的局限性，在可见光范围内光子容易被组织吸收和散射，很难穿透深层组织，因而只能用于体外研究或者不能实时动态观察靶细胞。在影像学领域中急切需要研究出一种标记简单，穿透力强，光学分辨率高的无创伤的标记/示踪方法。近年来，近红外荧光成像技术已经被广泛应用，其基本原理是以特定波谱范围的激发光源照射近红外荧光探针，此时荧光探针会被激发出不同光谱特性的光子信号。与可见光相比近红外荧光可穿透更深层的组织，特异性强，灵敏度高的特点，在体内外标记示踪过程有着广泛的应用前景。

现有荧光标记技术中，将荧光探针与生物分子结合的方式主要基于非共价的连接方式，这种方法虽然相对简便快捷，但得到的荧光标记生物分子不够稳定，示踪时间短，在应用上有很大限制。另一种连接方式是运用羧基与氨基间的缩合反应，可实现对生物分子的荧光标记。尽管这种方法是利用共价键的结合方式获得较为稳定的标记产物，但这类标记方法通常需要特定的催化剂进行催化，这给该方法的应用推广带来困难。而且在含有蛋白的生物分子和环境中，通常会存在有大量的氨基和羧基等基团，这使得染料和量子点荧光标记的特异性出现降低，同时还会影响对目标生物分子的标记效率。因此，为解决上述问题，以点击化学反应为基础将荧光探针标记到生物体上已开始应用于生物标记领域，因其共价键连接非常稳定，而且由于生物体系中不含有环炔基和叠氮基团，而点击化学反应中，只有含有叠氮基的细胞能和带有环炔基的染料或量子点反应，反应速度较快，不受反应体系中的其他因素干扰，具有很强的高效性与特异性。

通常，以点击化学为基础的荧光标记方法采用两步法，首先使细胞与带有环炔基的点击化学修饰连接剂结合，然后用叠氮-荧光标记物复合物对细胞进行荧光标记。但是，这种标记方法对细胞毒性大从而对细胞的活性影响较大，活性低不利于生物活体标记和检测。而且两步法标记比较繁琐，效率低。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种用含有叠氮基团的胆碱类似物修饰具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，以解决现有的以点击化学为基础的荧光标记方法对生物体活性影响较大的技术问题。

进一步地，本发明的目的在于提供一种操作简单、效率高的一步法荧光标记，以解决现有的两步法标记操作繁琐、效率低的技术问题。

为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

一种用于具有细胞膜结构的生物体的荧光标记方法，包括以下步骤：

将含有叠氮基团的胆碱类似物和具有细胞膜结构的生物体共培养，经新陈代谢后得到胆碱类似物修饰的生物体；

通过点击化学反应，用DBCO基团修饰的荧光标记物对所述胆碱类似物修饰的生物体进行标记，使得荧光标记物标记在生物体的细胞膜表面。