[发明专利]一种培养游动放线菌获取雷帕霉素发酵液的方法

说明书

技术领域

本发明属于发酵工程技术领域，具体涉及一种利用游动放线菌获取雷帕霉素发酵 液的方法。

背景技术

雷帕霉素(rapamycin,RPM)又名西罗莫司，是具有独特作用机制的含氮三烯大环 内酯类抗生素，具有抗真菌、抗增殖和抗肿瘤的作用。雷帕霉素是31元环组成的三 烯大环内酯类化合物，含有特殊的α、β-二酮乙哌啶酸酰胺分子掩盖的半缩酮，分 子式为C51H79NO13，分子质量为991，为白色的固体结晶，熔点为183-185℃，亲脂性， 微溶于水，几乎不溶于乙醚，但溶于甲醇、乙醇、丙酮、氯仿等有机溶剂。

雷帕霉素是目前世界上最有前途的新型强效免疫抑制剂，其分子结构类似于 FK506，但毒副作用小于FK506，是又一种亲免疫蛋白结合剂，可用于器官移植抗排 斥作用。它的活性比临床上使用的第三代免疫抑制剂环孢霉素强10-100倍，与环孢 霉素有协同免疫抑制作用，联合使用不仅能扩大两种药物的治疗指数，还能减少环孢 霉素的用量，减轻环孢霉素肾毒性的发生。雷帕霉素还可用于治疗类风湿性关节炎、 红斑狼疮等自身免疫性疾病，目前发展为基因治疗和抗肿瘤药物，具有广阔的应用前 景。

雷帕霉素主要通过微生物发酵的方法生产，由代谢产生雷帕霉素的吸水链霉菌或 其他菌株发酵富集和分离纯化得到。目前，国内外的研究主要针对吸水链霉菌，陈希 杨等(陈希杨等，化学工程，2011)研究了雷帕霉素发酵的最佳种子培养时间，发现 60h的种子液能够产生最高的发酵水平，并对发酵培养基进行了优化，确定了最优的 培养基配方。目前，雷帕霉素生物发酵生产存在的不足主要在于雷帕霉素的生物发酵 单位不高，不利于提取纯化，不能充分满足工业化生产的要求。

发明内容

为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明提供一种以游动放线菌为生产菌株，进 行发酵、获取雷帕霉素发酵液的方法。

所述生产菌株为游动放线菌（Actinoplanes sp、）诱变菌株BCStr-096，该菌株 于2013年11月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保 藏编号CGMCC NO.8430；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学 院微生物研究所，邮编100101，分类命名：游动放线菌Actinoplanes sp、。

一种培养游动放线菌生产雷帕霉素发酵液的方法，包括如下步骤：

（1）菌种活化

将甘油保存的游动放线菌（Actinoplanes）转接至保藏分离培养基，于恒温培养 箱中，28℃培养7-15d，至斜面由橙色变为黄褐色；

所述保藏分离培养基组成为：燕麦片1-4%，葡萄糖0.5-3%，酵母粉0.1-2%，蛋 白胨0.1-2%，碳酸钙0.1-0.5%，pH6.9-7.4，蒸馏水配制，121℃高压蒸汽灭菌20min；

（2）摇瓶种子培养

选择生长良好的活化斜面，取1cm2大小的菌种转接于新鲜种子培养基中，于28 ℃，180-250r/min的立式摇床上，培养40-55h；

所述摇瓶培养基组成为:可溶性淀粉1-3%，蛋白胨0.1-2%，葡萄糖0.5-3%，黄 豆饼粉0.5-4%，碳酸钙0.1-0.5%，pH6.9-7.4，蒸馏水配制，121℃高压蒸汽灭菌20min；

（3）种子罐种子培养：将摇瓶种子培养液以6-15%的接种量接种于种子罐培养 基中，28℃，培养38-52h，得种子液；

所述种子罐培养基组成为：可溶性淀粉1-3%，葡萄糖0.5-3%，黄豆饼粉0.5-4%， 玉米浆0.2-2%，硫酸镁0.05-0.4%，碳酸钙0.1-0.5%，pH6.9-7.4，蒸馏水配制，121 ℃高压蒸汽灭菌20min；

（4）发酵培养

将种子液以8-15%的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，通入无菌空气并 开启搅拌，于28℃，培养30-48h后，一次性补加发酵培养基总量4-6%的赖氨酸；继 续发酵110h-160h，得到雷帕霉素发酵液。