[发明专利]一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法

说明书

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法。

背景技术

尸胺，即1,5-二氨基戊烷，属于多胺中的二胺类，是尸体腐败产生气味中的成分之一。五碳化合物1,5-戊二胺（尸胺）作为一种生物基的平台化合物受到越来越多的关注，特别是作为新型的高性能生物基聚合物的构建单体。研究其生产菌株和生产工艺，供应生物基的1,5-戊二胺及其衍生品所能带来的巨大的经济效益也引起人们极大地兴趣。L一赖氨酸脱梭酶(L-lysinedecarboxylase,简称LDC,EC4.1.1.15),是可逆的将赖氨酸脱C0₂生成尸胺(1,5一戊二胺)的酶，此酶是诱导性胞内酶,需磷酸毗哆醛为辅酶促进脱羧反应，LDC存在于大肠杆菌、尸杆菌、蜂房哈夫尼菌等大多数微生物中。近年来，国内外学者对1,5-戊二胺的研究不断深入，从实验室水平的代谢途径和遗传基因，到工业中的扩大培养和提取衍生化，为1,5-戊二胺的大规模工业化生产提供了理论基础和技术指导。日本东丽尖端融合研究所用高效表达的大肠杆菌来源的赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌生产尸胺。蒋丽丽，焦庆才等研究了蜂房哈夫尼菌(H.alvei)As1.1009中，L-赖氨酸脱羧酶对L-赖氨酸的脱羧作用，分析了温度、pH、培养基、激活剂等因素对酶活的影响。但是依然存在尸胺发酵过程复杂，尸胺生产率不高，且发酵后菌体和发酵液分离困难等缺点。

包埋固定化微生物技术因为其包裹的微生物密度高、抗冲击能力强、稳定性好，适应性广等优点备受关注。传统发酵法利用蜂房哈夫尼菌生产尸胺，因为其发酵菌株浓度低，菌种对底物浓度的耐受性低，LDC的活性低，发酵转化后菌体和发酵液分离困难等缺点，使得尸胺的转化效率低，增加了生产成本。为此，研究一种利用包埋固定蜂房哈夫尼菌发酵生产尸胺，在转化过程中增加了菌种浓度、提高菌种底物的耐受性的包埋蜂房哈夫尼菌的技术是很有研究前景的。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一种固定化蜂房哈夫尼菌生产尸胺的方法。

技术方案如下：

（1）蜂房哈夫尼菌菌种三级培养；

（2）在无菌条件下利用包埋载体将菌种包埋固定；

（3）将固定化菌体投加到发酵罐中发酵转化生产尸胺。

所述的蜂房哈夫尼菌三级培养过程如下：

（1）一级培养-斜面培养：将试管菌种接种于斜面培养基，于35℃培养24-36h。

斜面培养基组成为（g/L）：蛋白胨10，牛肉浸膏5，NaCl5，玉米浆5，琼脂20，pH7.2。

（2）二级培养-种子培养：自一级斜面取1环菌接入装有50mL种子培养基的500mL三角瓶中，35℃，170r/min震荡培养12h。

种子培养基组成为（g/L）：蛋白胨10，牛肉浸膏5，NaCl5，玉米浆5，pH7.2。

（3）三级培养-发酵培养：将二级培养的种子液按5%接种量接入发酵罐，于35℃，通气量(v/v)1：1.5，搅拌转速300-600rpm，溶氧20%，培养24h。

发酵培养基组成为（g/L）：葡萄糖20，玉米浆20，酵母膏5，牛肉膏3，蛋白胨10，NaCl5，硫酸铵2，维生素B₆1，pH7.0。

优选的发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，玉米浆20g/L，酵母膏5g/L，牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，硫酸铵2g/L，维生素B₆1g/L，pH7.0。

经过三级培养得到的发酵液菌体浓度为5.5×10⁸-6.0×10⁸个/ml。

所述的包埋载体各组分质量比为：海藻酸钠:聚乙烯醇=55-70：2-5。

所述菌种包埋固定的方法如下：称取55-70g的海藻酸钠加入1000mL蒸馏水中，然后加入2-5g聚乙烯醇混合均匀，放入高压灭菌锅内121℃，灭菌30min，在超净台内冷却至室温形成凝胶。将500mL蜂房哈夫尼菌发酵液离心收集菌体然后用10mL生理盐水重悬并加入到凝胶中，搅拌混合均匀后用无菌的10mL注射器滴加到含2%的经过灭菌的CaCl₂溶液中，滴加完毕后放在超净台内室温继续交联10h，形成固定化小球，然后用经过灭菌的生理盐水洗涤3次既得包埋的蜂房哈夫尼菌颗粒。上述所有操作都必须在无菌条件下进行。