[发明专利]一种高效扩增CD3-CD56+的自然杀伤细胞培养系统的方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫学与分子生物学技术领域，涉及生物制品的扩增方法，尤其是一种高效扩增CD3^-CD56⁺的自然杀伤细胞培养系统的方法。

背景技术

NK细胞1975年被发现，在形态上属于大颗粒淋巴细胞，来源于骨髓，占外周血淋巴细胞总数的5%-10%。它具有广谱抗肿瘤细胞作用，特别是对淋巴细胞瘤和白血病细胞作用更为明显，是抗肿瘤免疫的第一道防线，针对NK敏感靶细胞（如K562细胞）的杀伤效应，该杀伤功能不受靶细胞是否表达MHC的影响；NK细胞还是连接天然免疫和获得性免疫的重要环节。在DC激发CTL反应的过程中，NK细胞能发挥类似TH细胞的辅助功能（Mailliard RB，etal.J.Immunol,2003，171：2366）。近期的研究表明，NK细胞和树突状细胞（DC）相互作用，能够提高DC激发CD4⁺TH1反应及CTL反应的能力（Adam C，et al.Blood,2005,106:338）。甚至NK细胞还有直接激活T细胞的能力。

由于NK细胞在免疫应答中的独特作用，其在肿瘤细胞治疗中应用越来越受到重视。然而，NK细胞在体内的数量越少，如何获得足够数量的NK细胞成为制约其临床应用的瓶颈，而且目前的方法扩增的NK对实体瘤的杀伤作用仍非常有限。另外，研究发现在肿瘤患者体内NK细胞数量增多其功能反而下降，NK细胞最多的人往往正是易患癌症的人，这说明肿瘤患者体内的NK细胞可能存在缺陷。因此，如何提高NK细胞的数量及增强其功能成为困扰医疗界的难题。

HER2蛋白是一种由原癌基因Her2／neu编码的具有酪氨酸激酶(tyrosine kinase，TPK)活性的跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区及胞内区构成，分子量185kDa，是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)家族成员之一。HER2在调节肿瘤细胞生长、分化及存活起着重要作用，HER2的过表达是由原癌基因扩增或转录异常，或基因突变激活所致。所以在人类肿瘤中，特别是许多恶性肿瘤中存在HER2不同程度的过表达。HER2主要通过多种途径促进细胞的增殖、分化以及抑制凋亡HER2还可通过促进Fnl4(fibroblast growth factorinducible14)的表达和增强肿瘤细胞对乙醇的敏感性等途径增强肿瘤细胞的浸润作用。Willis等发现在乳腺癌中HER2可促进Fnl4的表达，Ma等¨3l贝U发现在体外实验中过表达的HER2可使肿瘤细胞对乙醇的敏感性增强.随着肿瘤细胞中HER2相关的分子研究的深入，作用于新靶点的肿瘤治疗药物逐渐被研发，即出现了如抗HER2抗体、肽预苗、DNA预苗、HER2信号转导抑制剂等。靶向HER2相关分子的药物也取得一定抑制肿瘤的效果。

我们采用的抗HER2单抗是一种重组DNA衍生的人源化单克隆抗体，选择性地作用于人表皮生长因子受体-2(HER2)的细胞外部位。此抗体属IgGl型，含人的框架区，及能与HER-2结合的鼠抗-p185 HER2抗体的互补决定区。人源化的抗HER2抗体是由悬养于无菌培养基中的哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞CHO)产生的，用亲合色谱法和离子交换法纯化，包括特殊的病毒灭活的去除程序。

HER2过表达细胞对于肿瘤坏死因子a（TNF-a）的细胞毒作用常有抗性，抗HER2单抗处理细胞后，使其对TNF-a的敏感性增强。HER2过度表达的肿瘤患者较无过度表达的无病生存期短。HER2的过度表达可通过以下方法诊断：对肿瘤组织块以免疫组化为基础的评价法，组织或血浆样品的ELISA法或荧光原位杂交（FISH）。因此抗HER2单抗在体外及动物实验中均显示可抑制HER2过度表达的肿瘤细胞的增殖。另外，抗HER2单抗是抗体依赖的细胞介导的细胞毒反应（ADCC）的潜在介质。在体外研究中，抗HER2单抗介导的ADCC被证明在HER2过度表达的癌细胞中比HER2非过度表达的癌细胞中更优先产生。抗HER2单抗可以刺激机体产生针对肿瘤的特异性免疫反应诱导免疫记忆，打破免疫耐受从而有效的减少肿瘤复发、转移，提高患者的生存期提供了可能。