[发明专利]利用直接免疫PCR检测样品中污染物含量的方法

说明书

技术领域

本发明属于环境污染物检测技术领域，具体涉及一种利用直接免疫PCR检测样品中污染物含量的方法。

背景技术

环境污染物质是随着人类活动而出现、会对人类生存环境以及身体健康产生影响的一类化学物质。比如，沙丁胺醇（SAL）是β-兴奋剂家庭的成员，临床上常用于治疗支气管哮喘等呼吸系统疾病。由于其还可以促进动物生长，减少动物脂肪蓄积，增加瘦肉产量，因而被国内外许多养殖场用作饲料添加剂。然而，如果过多摄入SAL会对人体健康产生不利影响，包括出现心悸、头疼、目眩、恶心、呕吐，严重者甚至造成肝肾的损伤。因此，包括我国在内的多个国家已将该类药物列为禁用药物以及饲料添加剂。再比如，烟草中含有上千种对人体健康存在潜在威胁的物质，主动吸烟以及被动吸烟都会导致肺炎、肺癌、哮喘、心血管疾病、高血压以及生殖发育等。所有这些环境污染物质虽然分子量小，但却会对人类健康造成巨大的潜在威胁。随着人们生活水平的提高，越来越多的人开始注重生活环境以及身体的健康，因此，为了更准确的反应人体是否暴露于各种环境物质污染中，有必要建立一些快速、简便、高灵敏度的方法来测定生物样品（如尿样、血样等）以及环境样品（如水体、土壤等）中的污染物质的含量。

现有检测环境污染物质含量的方法有毛细管区带电泳法、气相色谱法、液相色谱法、高效液相色谱法和高效液相色谱-质谱联用法。但是这些仪器分析方法前处理复杂、耗时多且成本高。相比之下，酶联免疫法具有特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低和样本前处理相对简单等优点。但是，随着人们对健康要求的不断提高，有必要建立一些更高灵敏度的检测方法。

免疫PCR（Immuno-PCR，IPCR）由Sano等人提出，是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的极高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术，其主要程序包括：

（一）抗原+生物素化抗体→抗原-生物素化抗体复合物；

（二）加亲合素→抗原-生物素化抗体-亲合素复合物；

（三）加生物素化DNA→抗原-生物素化抗体-亲合素-生物素化DNA复合物；

（四）PCR扩增生物素化DNA部分。

将与抗原结合的特异性抗体通过连接分子与标记DNA结合，再进行PCR扩增，由此定量检测抗原，使敏感性高于ELISA和RIA。但目前免疫PCR技术大多被应用于多种微量蛋白及毒素的检测，用于小分子物质（分子量小于1000道尔顿）检测的研究相对较少。

文献（H.-Y.Chen and H.-S.Zhuang.A Real-Time Immuno-Polymerase Chain Reaction Assay for Detecting Polychlorinated Biphenyls in the Environment.Analytical and bioanalytical chemistry,2009,394,1205-1211.）公开了采用免疫PCR检测环境样品中多氯联苯，其主要步骤包括：抗原包被—特异抗体与小分子（即多氯联苯）竞争—加生物素标记二抗—加亲和素—加生物素标记DNA—PCR扩增。

该方法属于间接免疫PCR法，与现有技术中其他免疫PCR方法相同，均是通过生物素与亲和素系统使特异抗体与DNA连接，但一个亲和素分子可以结合四个生物素分子，难以排除检测结果中会存在误差的可能性，而且整个过程步骤繁琐，不利于实际应用。

发明内容

本发明提供了一种利用直接免疫PCR检测样品中污染物含量的方法，该方法步骤简单，且检测结果灵敏性和准确性均较高。

利用直接免疫PCR检测样品中污染物含量的方法，包括：

（1）取待测物标准品，制备标记DNA-标准品偶联物；

（2）将可与待测物特异性结合的抗体固定在支持物上，添加待测样品和标记DNA-标准品偶联物，进行竞争性结合反应，反应完成后洗涤；

（3）洗涤完成后，加入PCR反应体系，以标记DNA为模板，进行实时荧光定量PCR，得到CT值；

（4）根据标准曲线，利用CT值计算待测样品中待测物的含量。

本发明针对待测样品中污染物建立了一套直接免疫PCR检测体系，只需“特异抗体包被—竞争结合—PCR扩增”三个步骤即可完成对待测样品中待测物含量的检测，并且预先将待测物标准品直接与DNA偶联，未在反应体系中引入其他连接分子，抗原抗体特异结合，大大提高了检测灵敏度和准确性。