[发明专利]一种测定样品中抗原含量的方法

说明书

本专利要求基于美国临时专利申请，61/583,624，申请日期：2012年1月6号；美国专利申请13/459192，现为美国专利ＵＳ8293487，申请日期，2012年4月29号；美国专利继续申请，13/656715，申请日期，2012年10月21号，以及国际专利申请ＰＣＴ/ＵＳ2013/020138，出版号码，ＷＯ2013/103712的申请优先权。

技术领域

本发明涉及对包括化合物、多肽、蛋白质、RNA、DNA、细胞(在原位释放的蛋白质)、或病毒颗粒(在原位释放的蛋白质)等抗原的免疫检测处理。更重要的是，本发明包括，但不局限于免疫印迹分析、斑点印迹分析以及酶联免疫吸附测定法等免疫检测方法，提供了相应的创新，使之更简单，可定量测量，从而达到其在多孔板格式的应用的目的，以及实现蛋白质分析的自动化。

背景技术

蛋白质分析是现代生物学研究的重要基础。这项技术基于抗原-抗体相互作用的原理，来测量目标抗原在各种医疗或实验条件下的表达水平。抗原指当进入人体时，能够触发免疫系统产生特异抗体的外来分子。抗体由于其针对特定抗原的高特异性，成为临床、制药和生物医学研究中一个有力的工具。抗原包括，但不限于，一种化合物、多肽、蛋白质、RNA分子、DNA分子、细胞(在原位释放的蛋白质)或病毒颗粒(在原位释放的蛋白质)。完整或部分抗原分子，可被引入到包括驴、山羊、兔子等宿主动物体内，产生大量针对目标抗原的抗体。此外，导入的抗原或抗原的一部分，可能具有一个或几个抗原决定簇，因此，由于抗原决定簇数目的不同，宿主体内可能产生一个或多个针对目标抗原的特异性抗体。

一个典型的免疫检测过程可以分为三个主要步骤，其中包括：(i)，点样，将含有目标抗原的样品首先转移到膜上，如硝酸纤维素膜，PVDF膜或像具有结合蛋白质能力的多孔板一类的固相载体；(ⅱ)，阻塞/处理/洗涤步骤。这一过程又包括多个子步骤。首先，(a)点样后的膜被封闭缓冲液处理来避免抗体非特异性结合到膜上，然后在(b)中，膜和含有抗体的封闭缓冲液一起培育，从而在膜上形成抗原抗体复合物。而没有机会和目标抗原结合的抗体在这一过程中被洗掉。在这一步骤中，使用的抗体有的被标记酶直接标记，有的通过被标记酶标记的第二抗体间接标记。(iii)样品的检测，通过在膜上与抗体耦合的标记酶的酶促反应，与膜结合的免疫复合物的数量或者质量及其他相关信息得到检验。在斑点印迹分析和免疫印迹分析中，免疫检测分析的最终结果可以进一步通过光密度分析的方法间接进行量化处理。

在这个广义的检测过程中，每个步骤在实践中都可能有所变化。例如，在步骤(i)中，点样的方法有多种。这些方法包括斑点印迹分析中的直接点样，免疫印迹分析中样品通过凝胶转移，和酶联免疫吸附法中样品涂层的方法。在步骤(ii)，各种处理方法和不同成分的缓冲阻塞液在实践中被采用以达到最大限度地保存结合在膜上的免疫复合物的目的，并同时清除掉直接结合在膜上的抗体。在大多数情况下，标记酶并不被直接用来标记第一抗体。被标记酶标记的第二抗体通过与在膜表面上与目标抗原结合的第一抗体产生抗原抗体反应来间接标记第一抗体。在步骤(iii)中，除了标记酶标记，其他方法也被用于标记抗体，从而导致了不同的检测方法。例如，产生出深浅不同的颜色变化通过目视加以比较；或者产生化学发光信号，通过发光读数仪或X射线胶片进行检测。在检测过程中抗体也可以通过荧光加以标记，而形成的产物在特定的波长通过多孔板读数仪进行定量化分析。

当然，这个对广义的免疫检测过程的描述仅仅是被用来说明常规免疫检测分析的基本原理。它不可能涵盖了在这一过程中各种不同的方式方法。因而有所遗漏则在所难免。但是这些没有被包括进去的方式方法在原理上同这个广义的免疫检测过程是一致的。

斑点印迹分析则是上述免疫检测过程的一个典型应用。这种方法因为直接在膜上点样形成一个斑点而得名。这种方法虽然简单、快速，但由于缺乏特异性，导致其在生物医学，临床和制药研究中的应用受到了限制。在多数的情况下，用于免疫检测反应的抗体由于种种原因而与多个抗原产生抗原抗体反应。因此，在斑点免疫分析中的标记酶的酶促反应难以可靠地反映目标抗原在待测样品中的含量。正因为这个原因，无论是免疫印迹分析还是酶联免疫吸附法都由于其提高的特异性而在蛋白质分析中得到广泛应用。