[发明专利]一种特异性地标记活细菌的方法

说明书

技术领域

本发明涉及在含有细菌的样品中特异性地标记以及更尤其是特异性地检测活细菌的方法。

背景技术

检测活细菌的传统方法涉及在固态介质上培养细菌，并通过观察菌落进行计数。因培养需要很长时间，所以这样的方法并不快。另外，这些方法必须仅限于检测可培养的细菌，而非活细菌。的确，它的定量是不可靠的，因为已经有人指出在固态介质上一些细菌由于培养压力而被杀死。实际上，使用平板计数，微生物学家已经提出重要的假设，在某种意义上他们假设这种方法对细菌无有害作用。然而，从1950年代已经报道，当厌氧呼吸期间天然产生的活性氧类的清道夫(丙酮酸盐、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶…)被加入到琼脂板时，死细胞显然可以被再激活[40-48]。例如，各种压力，如饥饿、HOCl、热击和干燥，可能使细胞处于一个脆弱的生理状态，其中在恢复期间，大气中的氧气增强主要压力源(stressor)的毒性作用。

为了克服这些局限，已经提出一些间接的不基于培养的方法来评价细菌的生存能力，所有这些也都有优点和缺点。因此，尚没有被一致认同是适于所有情况的方法。这些方法通过两个标准之一评价生存能力、代谢活性的说明或细胞结构的维持。

在荧光技术使用之前，用于指示细胞代谢活性的方法包括使用微-放射自显影[25]，以及可诱导的酶活性[26]作为蛋白从头合成的指示剂，直接活力计数方法(DVC)[27]基于添加营养时的细胞扩大，和四唑盐的降低作为活性电子运输链的指示[28]。然而，这些方法有使用相关的缺点。DVC和四唑盐降低分析需要营养添加[28,29]，并因此依赖于有机体对所提供的营养的反应能力。呼吸测量也有其缺点。已经指出一些因素影响来自四唑盐还原的甲瓒沉积物的形成[29]，并且一个报道指出四唑盐5-氰基-2,3-二甲苯基四唑鎓氯化物，阻止细菌代谢[30]。

基于荧光染料的细胞染色的细胞生存能力分析也已经开发。这些方法通过稳定细胞结构的维持来评价生存能力。吖啶橙直接计数[31]和4P,6-二脒基-2-苯基吲哚染色[32]已经用作完整核酸维持的指示。罗丹明123已经广泛用于膜电位的指示剂，并随着流式细胞术的发展，已经有大量描述细胞生理状态特征的方法[33]。在有些有机体中这些染料的渗透性可能是一个问题。最近，一些新的分析已经用于评价细菌生存能力，这些描述代谢活性(如酯酶活性，其后是ChemChrome V6荧光探针)[34]、细胞完整性(如膜的完整性-BacLight Kit)、膜电位、细胞内pH[35]和最终的ATP[36]的一些方面。最后，自2002年以来涉及有活力的细菌病原体的基于信使RNA的检测和病原体的实时PCR定量的新方法已经开发出来[37]。

使用允许在单细胞水平检测有活力的细胞的方法，微生物学家已经提出一个重要的假设，在某种意义上他们假设这些细胞随时间将能够再次生长。然而，一些作者已经提出这个观察是细胞恶化的结果，并且有活力但是不能培养的细胞正在其死亡的过程中[40,49]。

结果，可以预期明显有活力的细胞数目高估了真正活细胞的数目(可培养，即能够随时间分裂/繁殖)。

然而很多这些方法具有以上所述的缺点，更明显的是非活的细菌保持着这些方法所涉及的有活力的细胞的某些特征，如酶活性。因此，这些方法涉及大量的假阳性检测和定量，并且检测到的和定量的细菌数目不够可靠。

本发明的目标是提供一种新的改进的间接的基于非培养的用于特异性地检测活细菌的方法，尤其是克服以上所述的缺点并提供更可靠的检测和可培养细菌精确数目的定量。

代谢的聚糖(glycan)标记[1]最近已经出现作为研究细菌表面聚糖的一种非常强大的工具，应用范围从活的多细胞有机体(如斑马鱼或小鼠)成像到细胞表面唾液酸糖蛋白相关的新陈代谢的鉴定[2]。这个策略依赖于携带生物正交化学报告分子(reporter)的修饰单糖被细胞生物合成机器的同化。这种报告分子代谢并入到聚糖可以通过与标记(如荧光探针)的化学连接而进一步被观察到。有些惊奇的是，研究主要集中于用常见的单糖衍生物标记脊椎动物聚糖[3]，如N-乙酰神经氨酸或其N-乙酰甘露糖胺前体、N-乙酰葡萄糖胺、乙酰半乳糖胺和海藻糖。

尽管单糖基本成分(building block)更高程度的多样性以及细菌-宿主相互作用和细菌毒力的必要作用，细菌多糖的体内结构修饰未得到良好的探索。细菌分为革兰氏阳性和革兰氏阴性菌。然而，革兰氏阳性菌被肽聚糖细胞壁所包裹，革兰氏阴性菌被嵌入其外膜的致密脂多糖(LPS)层所覆盖，其参与细胞的结构完整性，并常常被认为是致病因素。