[发明专利]溶菌酶作为标签的用途

说明书

背景技术

重组多肽和蛋白的表达和纯化是生物技术研究内的常规工序。通常，纯化工序包括期望的多肽在原核细胞或真核细胞内的表达，之后是与宿主细胞的其他非蛋白类(non-proteinacious)颗粒和蛋白类颗粒的分离。由此使用多种类型的层析法例如通过大小、电荷或疏水性来纯化期望的分子。

一个进一步的具体策略是使用与目标多肽融合的标签。特定的标签可用于支持目标多肽的折叠、可溶性、稳定性和表达，而其他标签主要用于纯化。因此，期望的多肽在原核细胞或真核细胞中作为融合构建体被表达，且可以通过经由特异性抗原结合部分检测的融合标签来进行纯化。这种类型的纯化策略被称为亲和层析。

例如，用于科学界的一个纯化标签是His标签。因此，可以通过使用例如具有固定化的对His标签具有强亲和性的镍或钴离子的纯化柱来分离与His标签融合的多肽。然后，在包括咪唑的洗脱工序中从柱子中释放蛋白，其中咪唑与His标签竞争与镍或钴的结合。进一步的实例是Flag标签和Strep标签，它们都融合到目标多肽上并分别对于各自的标签特异性的抗原结合部分例如抗体或Streptactin充当抗原。例如，用于纯化(例如，分别经由Flag标签、Strep标签或His标签)的这些结合部分(例如，抗体、streptactin或金属离子)可以例如固定在固体基质上(例如，膜、珠)上。与用于特定标签的特异性结合部分连接的那些固体基质可以用于容易地从作为裂解物或条件培养基的复杂样品中捕获带标签的多肽。然而，作为短肽，Flag标签、Strep标签和His标签有时不易进入特定的多肽或蛋白的3维结构内，因而不适合用于纯化。另外，经由Strep标签从哺乳动物细胞培养物上清液进行的纯化由于大多数介质的高生物素浓度而受损。

某些较大的球状标签可以支持难于表达的多肽作为蛋白的折叠、可溶性和表达。开发的大多数可得的基因融合技术是在大肠杆菌中表达并从粗裂解物中纯化。这些融合蛋白的实例是MBP(麦芽糖结合蛋白)、GST(谷胱甘肽-S-转移酶)和SUMO(小的泛素修饰蛋白；参见例如，WO03/057174)。

SUMO-标签最初被设计用于原核表达(例如，SUMOpro^TM表达试剂盒，http://www.lifesensors.com)，然后被进一步研发用于哺乳动物表达(SUMOstar^TM表达试剂盒，http://www.lifesensors.com)。SUMO起伴侣(chaperon)和蛋白折叠引发剂的作用，以改进目标蛋白的可溶性和表达水平。通过使用去SUOM酶(desumoylase)，可以去除融合到目标蛋白的N端上的SUMO标签，导致蛋白的天然N端的产生。将SUMO标签融合到目标蛋白的C端不能实现融合标签的去除。纯化与SUMO标签融合的目标蛋白并不利用SUMO标签，但是需要应用纯化标签，如His标签。

用于哺乳动物表达的可选途径是使用Fc标签，其包括人类IgG1的铰链区、CH2和CH3结构域。Fc标签用于支持特定多肽的表达、折叠和分泌，同时也被用作其纯化的标签。His标签和Flag标签是具有低分子量的短肽，且较好地适用于可溶性多肽和蛋白的表达，而Fc标签是超过200个氨基酸的多肽，其支持特定的较不溶性的疏水性蛋白的表达。然而，相对较大的Fc部分形成二硫键桥接的聚集体，引起分离的和纯化的目标蛋白的二聚体或多聚体形式。

其他常见替代者是GST(谷胱甘肽S-转移酶)和MBP(麦芽糖结合蛋白)，其分别结合谷胱甘肽和麦芽糖。两种标签都具有高分子量(>25kDa)且显著地提高目标多肽或蛋白的可溶性和稳定性。然而，两种基因融合系统都不能用于进行分泌蛋白从条件哺乳动物细胞培养上清液中的蛋白纯化，因为培养基的成分阻止融合标签与其结合伴侣(即谷胱甘肽或麦芽糖)的结合。另外，两种融合标签都具有在哺乳类表达系统中聚集的倾向和也易于形成内含体。

因此，例如Fc标签不适合用于单体多肽和蛋白的表达和纯化，所有其它可用的标签也具有特定的优点和缺点且不适合用于某些特定多肽或蛋白的表达和/或纯化。汇总言之，表达和纯化的质量不仅取决于目标多肽或蛋白的性质，而且取决于所使用的各个标签。因而，特定标签与特定的目标多肽或蛋白的组合对于最佳结果而言是重要的，但却难以预测。因此，对于能够实现特定的挑战性的重组多肽和蛋白的表达和纯化或改善其质量的新型便利标签有着无尽的需求。本申请中公开的方法提供了通过利用溶菌酶作为标签来表达和纯化多肽或蛋白的有效途径。

发明内容