[发明专利]用于脑膜炎球菌中增加的蛋白表达的启动子

说明书

本申请要求2012年2月2日提交的美国临时专利申请61/594,159的优先权，其全部内容通过引用纳入本文。

技术领域

本发明属于用于在脑膜炎球菌中控制转录的启动子的领域。

背景技术

脑膜炎奈瑟球菌(Neisseria meningitidis)是细菌性脑膜炎的病因。脑膜炎球菌疫苗接种的一个方法依赖于外膜囊泡(OMV)，如在诺华(Novartis)MENZB^TM产品和挪威公共卫生研究院(Norwegian Institute of Public Health)MENBVAC^TM产品中所使用，两者都通过脑膜炎球菌的去污剂处理产生。

已知改变脑膜炎球菌外膜的蛋白组成，并且因此改变OMV的组成。已经描述了敲除不需要的基因并且过表达需要的基因。参考文献1-2，3报道了OMV疫苗的临床前研究，其中fHbp(也称为GNA1870)过表达(并且这种过表达可以与LpxL1[4]的敲除结合)。参考文献5报道了5种配方的OMV疫苗的临床研究，其中敲除了PorA和FrpB并且过表达Hsf和TbpA。参考文献6报道了由具有灭活的synX和lpxL1基因、过表达的fHbp、两种不同的PorA蛋白和稳定化的OpcA表达的细菌制备的天然外膜囊泡疫苗的I期临床研究。参考文献7报道了由具有灭活的synX和lpxL1基因(和，在两个情况中，灭活的lgtA)、两种不同的PorA蛋白和过表达的NadA或fHbp的细菌制备的三价天然外膜囊泡疫苗。如果通过不去除LPS的方法产生囊泡，诸如lpxL1的基因的灭活是重要的。

蛋白组成中的这些变化可以多种方式实现。例如，细菌可以在铁限制条件下生长以促进与铁代谢相关的某些蛋白的表达。其他技术可以包括对细菌的工程改造。例如，参考文献8提出可以使用强启动子(诸如porA、porB、lgtF或hpuAB启动子)来上调保护性外膜蛋白的表达，或可以去除抑制性转录控制机制。参考文献9提出可以对基因进行工程改造以去除它们的相可变性。在参考文献7中使用porA启动子来过表达NadA，而使用tac启动子过表达fHbp。

本发明的目标是进一步提供并且改善在脑膜炎球菌中改变蛋白表达的方式，并且尤其是提供用于驱动感兴趣基因的表达的启动子。可以使用上调来增加在OMV中有用蛋白的水平。

发明内容

本发明的第一方面使用经修饰的porA启动子来驱动转录。如参考文献8的实施例10-16中使用的天然porA启动子在其-35到-10区域之间含有聚-G序列，但是该序列可能造成相转变并且因此来自天然porA启动子的表达可能不稳定。本发明的经修饰porA启动子有改善，因为它们缺少野生型聚-G序列。

因此，本发明提供了包含启动子的核酸，其包括：

(i)来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-10区域和/或

(ii)来自脑膜炎球菌porA基因启动子的-35区域，

其中-10区域和-35区域通过12-20个核苷酸的间插(或间隔子)序列隔开，并且其中间插序列不含聚-鸟嘌呤(guanidine)序列或者包括具有不超过8个连续鸟嘌呤核苷酸的聚-鸟嘌呤序列。

本发明的第二方面使用来自脑膜炎球菌rRNA编码基因(诸如16S rRNA基因)的启动子来驱动蛋白编码基因的转录。因此本发明也提供包含与下游的蛋白编码基因可操作连接的启动子的核酸，其中该启动子包括(i)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域和/或(ii)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域。

本发明也提供包含来自与具有5′UTR的蛋白编码基因可操作连接的rRNA基因启动子的启动子区域的核酸，所述5′UTR含有蛋白表达的翻译调节元件。启动子区域可以包括(i)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-10区域，(ii)来自脑膜炎球菌rRNA基因启动子的-35区域，和(iii)来自基因如porA基因的5′UTR。

本发明也提供了包含启动子的核酸，其包括SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：18的变体，所述变体与SEQ ID NO：18之间存在最多4个(例如，1、2、3或4个)单核甘酸插入、删除或取代的差异。

可以杂合形式使用porA和rRNA启动子，例如具有来自porA启动子的-10区域和来自rRNA启动子的-35区域(其可以是共有的-35区域)。因此，本发明也提供了包含启动子的核酸，其包括：