[发明专利]一种抗草甘膦融合蛋白及其编码基因、产生方法与应用

说明书

技术领域

本发明涉及融合蛋白及其编码基因与应用，特别是涉及一种融合的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase，EPSPS)及其编码基因、获得该融合蛋白的方法及其在培育抗草甘膦植物中的应用。

背景技术

草甘膦是一种非选择性除草剂，具有理化性质稳定、高效、广谱、低毒、低残留、易于被微生物分解、不破坏土壤环境等优点，已广泛应用于农业生产中，成为目前世界上生产量最大的农药品种。草甘膦的作用机理主要是竞争性抑制莽草酸途径中5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的活性。该酶是真菌、细菌、藻类和高等植物体内芳香族氨基酸(包括色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)生物合成过程中的一个关键酶，其具有由两个保守的亚基组成的哑铃状结构。草甘膦是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的类似物，是竞争性EPSPS抑制剂，草甘膦、EPSPS和三磷酸莽草酸(S3P)结合形成EPSPS-S3P-草甘膦复合体(此复合体非常稳定)，抑制EPSPS的活性导致分支酸合成受阻，阻断芳香族氨基酸和一些芳香化合物的生物合成，最终导致一些激素和关键性代谢物如类黄酮、木质素和酚类化合物代谢失调，从而扰乱生物体正常的氮代谢而使其死亡。

1976年，美国孟山都公司的草甘膦类除草剂-农达(Roundup)研制成功并得到广泛应用。随着植物基因工程技术的发展和应用，抗草甘膦除草剂的转基因作物研究已成为热点。目前，转EPSPS基因的抗草甘膦除草剂转基因作物已经在多个国家广泛应用。

目前利用EPSPS基因开展植物抗草甘膦研究主要有两种方法：

第一种，是在植物中过量表达EPSPS，并以此拮抗草甘膦的竞争性抑制。Amrhein等通过逐渐增加草甘膦的浓度，加大草甘膦的选择压力，分离获得了一个耐草甘膦的矮牵牛细胞系。分析这个细胞系中的EPSPS基因，发现该细胞系的基因组中EPSPS基因的拷贝数扩增了20倍，使该酶的产量大大增加(Amrhein N,Johanning D,et al.Biochemical basis for glyphosate-tolerance in a bacterium and plant tissue culture.FEBS Lett.,1983,157:191-196)。

第二种，是使EPSPS发生突变，使其在保持催化活性的同时降低对草甘膦的亲和性，甚至不亲和。Stalker等从鼠伤寒沙门氏菌中分离到对草甘膦表现抗性的菌株，研究发现EPSPS的第101位的脯氨酸残基变为丝氨酸残基,将突变体编码基因转入烟草后可使转基因烟草对草甘膦的抗性提高(Stalker DM,Hiatt WR,et al.A amino acid substitution in the enzyme 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase confers resistance to the herbicide glyphosate.J Biol Chem,1985,260:4724-4728)；Padgette等将来自大肠杆菌的aroA基因编码的EPSPS的第96位的甘氨酸残基突变为丙氨酸残基，结果发现突变蛋白对草甘膦的结合活性显著降低，将编码该突变蛋白的基因在矮牵牛中表达后可显著提高其对草甘膦的抗性(Padgette SR,Re DB,Gasser CS,et al.Site-directed mutagenesis of a conserved region of the 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase active site.J Biol Chem,1991,266:22364-22369)；朱桢等(2005，专利申请号：200510002739.7)通过易错PCR(Error-Prone PCR)方法获得水稻的抗草甘膦突变体，其EPSPS的第106位氨基酸残基由脯氨酸残基变为亮氨酸残基；Michael Spnecer等将玉米EPSPS第102位的苏氨酸残基突变为异亮氨酸残基，第106位脯氨酸残基突变为丝氨酸残基，使含有该突变的EPSPS的编码基因的植株获得抗除草剂特性(美国专利号：6040497)。本申请人曾将来自棉花的EPSPS第101位苏氨酸残基定点突变为异亮氨酸残基，第105位脯氨酸残基改变为丝氨酸残基，获得可提供一定草甘膦抗性的EPSPS突变基因(PCT/CN2010/078327)。