[发明专利]枯草杆菌蛋白酶变体以及编码它们的多核苷酸

说明书

序列表的引用

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发明背景

发明领域

本发明涉及在一种或多种特性上相对于亲本枯草杆菌蛋白酶展示出改变的新颖枯草杆菌蛋白酶变体，这些特性包括：洗涤性能、热稳定性、储存稳定性或催化活性。本发明的这些变体适合用于在例如清洁或洗涤剂组合物中使用，如衣物洗涤剂组合物和餐具洗涤剂组合物，包括自动餐具洗涤剂组合物。本发明还涉及编码这些变体的分离的DNA序列、表达载体、宿主细胞以及用于产生和使用本发明变体的方法。

相关技术说明

在洗涤剂工业中，酶在洗涤配制品中的应用已经超过30年。用于此类配制品的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纤维素酶、甘露糖苷酶以及其他酶或其混合物。商业上最重要的酶是蛋白酶。

越来越多的商业上使用的蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白质工程变体，例如艾威蛋白酶波力低温蛋白酶液体蛋白酶超级液体蛋白酶和(诺维信公司(Novozymes a/s))，和(杜邦/杰能科国际公司(DuPont/Genencor International、Inc.))以及BLAP(图29，US5352604)(汉高股份有限公司(Henkel AG&Co.KGaA))。

此外，本领域描述了多种变体，如在WO 04/041979(诺维信公司)中描述了相对于亲本枯草杆菌蛋白酶在例如洗涤性能、热稳定性、储存稳定性或催化活性方面展示出变化的多种枯草杆菌蛋白酶变体。这些变体适合用于在例如清洁或洗涤剂组合物中使用。

已描述多种有用的枯草杆菌蛋白酶变体，其中很多已在不同洗涤剂中提供了改进的活性、稳定性以及溶解度。WO 94/02618描述了具有改进的储存稳定性的枯草杆菌蛋白酶变体。取代L211X和N212Z(其中X是除L以外的任何氨基酸并且Z是除N以外的任何氨基酸)与若干其他突变一起被提及。然而，针对这些变体未显示洗涤性能并且未提及关于特定污物(如鸡蛋污物)的信息。在本领域中熟知鸡蛋污物特别难于完全清除并且尽管已经例如在WO 01/44452中描述了对鸡蛋污物具有改进性能的若干蛋白酶变体，但是对于对各种污物(包括鸡蛋污物)具有高洗涤性能的蛋白酶仍存在需要。

因此，本发明的一个目的在于提供一种蛋白酶的与其亲本蛋白酶相比具有改进特性的多种变体。

发明概述

本发明涉及具有蛋白酶活性的枯草杆菌蛋白酶变体，这些变体包括对应于SEQ ID NO:2的Y217X和N218Z的取代，其中X和Z选自下组，该组由以下各项组成：K、H、R、D、E、S以及T。因此，本发明的一个方面涉及具有蛋白酶活性的枯草杆菌蛋白酶变体，这些变体包括对应于SEQ ID NO:2的Y217X和N218Z的取代，其中X和Z选自下组，该组由以下各项组成：K、H、R、D、E、S以及T，其中当X是D、E、S或T时，则Z也选自D、E、S或T并且其中当X是K、H或R时，则Z也选自K、H或R。本发明还涉及具有蛋白酶活性的枯草杆菌蛋白酶变体，这些变体包括对应于SEQ ID NO:2的Y217X和N218Z的取代，其中X和Z选自下组，该组由以下各项组成：K、H、R、D、E、S以及T，并且其中当X是D、E、S或T时，则Z也选自D、E、S或T，其中当X是K、H或R时，则Z也选自K、H或R，并且其中这些变体具有一个与SEQ ID NO:2和/或4至少60％一致的氨基酸序列。

本发明还涉及编码这些变体的分离的多核苷酸；包含这些多核苷酸的核酸构建体、载体和宿主细胞；以及产生这些变体的方法。

本发明还涉及一种用于获得具有枯草杆菌蛋白酶亲本蛋白酶的蛋白酶活性的变体的方法，该方法包括向亲本枯草杆菌蛋白酶中引入对应于SEQ ID NO:2的Y217X和N218Z的取代，其中X和Z选自下组，该组由以下各项组成：D、E、R、K、H、S以及T，其中当X是D、E、S或T时，则Z也选自D、E、S或T并且其中当X是K、H或R时，则Z也选自K、H或R；回收该变体并且测试所述变体是否具有蛋白酶活性。优选地，这些变体与SEQ ID NO:2和/或4具有至少60％的序列一致性。本发明还涉及通过这样的方法获得的变体。

本发明进一步地涉及组合物，如清洁和洗涤剂组合物，并且涉及本发明的这类组合物以及变体在清洁过程(如洗衣和/或餐具清洗)中的用途。

定义