[发明专利]利用单个粒子检测的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序

说明书

技术领域

本发明涉及一种光分析技术，能够使用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统，检测分散或溶解在溶液中的原子、分子或它们的聚合体(以下将它们称为“粒子”。)、例如蛋白质、肽、核酸、脂质、糖链、氨基酸或它们的聚合体等生物体分子、病毒、细胞等粒子状的对象物、或非生物学粒子，来获取在分析或解析它们的状态(相互作用、结合/离解状态等)时有用的信息，更详细地说，涉及一种能够使用如上所述的光学系统逐个检测由于存在单个粒子而引起的光的变化(单个粒子发出的光或单个粒子所产生的阴影)并进行各种光分析的光分析装置、光分析方法以及光分析用计算机程序。此外，在本说明书中，所检测的光可以是荧光、磷光、化学发光、生物发光、散射光等。发光的粒子(以下称为“发光粒子”。)可以是其自身发光的粒子、或附加了任意的发光标识或发光探针的粒子。

背景技术

由于近年来的光测量技术的发展，使用共焦显微镜的光学系统和还能够进行光子计数(单光子检测)的超高灵敏度的光检测技术，能够检测/测量单光子或荧光单分子水平的微弱光。因此，提出了各种使用这样的微弱光测量技术对生物体分子等的特性、分子间相互作用、或结合/离解反应进行检测的光分析技术。作为这样的光分析技术，例如已知有荧光相关光谱分析(Fluorescence Correlation Spectroscopy：FCS。例如参照专利文献1-3、非专利文献1-3)、荧光强度分布分析(Fluorescence-Intensity Distribution Analysis：FIDA。例如专利文献4、非专利文献4)、光子计数直方图(Photon Counting Histogram：PCH。例如专利文献5)等。另外，在专利文献6～8中，提出了根据利用共焦显微镜的光学系统测量出的样本溶液的荧光信号的时间经过来检测荧光性物质的方法。

并且，本申请的申请人在专利文献9～11中提出了利用共焦显微镜或多光子显微镜的光学系统等能够检测来自溶液中的微小区域的光的光学系统的、基于与FCS、FIDA等光分析技术不同的原理的新的光分析技术。在上述的FCS、FIDA等光分析技术的情况下，通过计算统计性的波动的运算处理来针对通过连续地测量来自浮游于作为样本溶液内的光的检测区域的微小区域(以下称为“光检测区域”。)的荧光分子的光而得到的光强度数据进行解析，从而检测荧光分子的浓度和/或其它特性。对于此，在专利文献9～11所提出的新的光分析技术中，一边使光检测区域的位置在样本溶液中移动、即一边通过光检测区域对样本溶液内进行扫描，一边在光检测区域包含在样本溶液中分散且随机运动的发光粒子时逐个检测从该发光粒子发出的光，由此，能够对样本溶液中的发光粒子逐一地进行检测，来获取与发光粒子的计数、样本溶液中的发光粒子的浓度或数密度有关的信息。根据该光分析技术(以下称为“扫描分子计数法”)，与FCS、FIDA等光分析技术同样地，进行测量所需要的样本可以是微量的(例如几十μL左右)，另外，测量时间短(在一次测量中反复进行多次秒级时间的测量。)，并且能够在作为观测对象的粒子的浓度低于FCS、FIDA等光分析技术能够良好地进行测量的水平(1nM左右)的样本溶液中检测发光粒子的存在，并定量地检测其浓度、数密度或其它特性。

这样，期待“扫描分子计数法”在对医学、生物学的研究开发领域中经常使用的稀少或昂贵的样本进行分析的情况下，或在疾病的临床诊断、生理活性物质的筛选等检测体数多的情况下，成为与以前的生物化学方法相比能够廉价或迅速地执行实验或检查且能够检测无法良好地执行FCS、FIDA等的程度的更低浓度的粒子的浓度和/或特性的强力工具。

专利文献1：日本特开2005-098876

专利文献2：日本特开2008-292371

专利文献3：日本特开2009-281831

专利文献4：日本特许第4023523号

专利文献5：国际公开2008-080417

专利文献6：日本特开2007-20565

专利文献7：日本特开2008-116440

专利文献8：日本特开平4-337446号公报

专利文献9：国际公开第2011/108369

专利文献10：国际公开第2011/108370

专利文献11：国际公开第2011/108371

非专利文献1：金城政孝、蛋白质核酸酶Vol.44、No.9、1431-1438页1999年