[发明专利]重组固氮微生物及其用途

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学和基因工程领域。本发明涉及重组微生物，特别地，涉及能够在固定的氮、氧或其组合存在下固定大气氮的重组固氮菌。

发明背景

生物固氮(BNF)发生在大气氮被称为固氮酶的酶转化成氨时。仅一些选定的微生物能够将氮从丰富的气体形式转换成可利用的结合的氮化合物。固定氮的微生物称为固氮细菌。负责固氮酶活性的酶很容易受到氧的破坏。nif基因负责编码固氮酶蛋白和涉及并与将大气氮固定成植物可用的氮形式相关的其他蛋白质。nif基因有正调控因子和负调控因子二者。除固氮酶外，nif基因还编码大量的涉及氮固定的调控蛋白。nif基因的表达是作为对固定的氮的低浓度和低氧浓度的反应诱导的(低氧浓度是在根环境中主动维持的)。在大多数固氮微生物中，nif基因转录的激活由NifA蛋白完成。当没有足够的固定的氮可供固氮菌使用时，nifA基因的天然启动子引发NifA表达，而NifA蛋白反过来导致剩余nif基因转录的激活。如果有足够量的还原氮或存在氧，那么nifA基因启动子不会被激活且没有NifA蛋白表达发生。另一方面，另一种蛋白质，NifL，在还原氮或氧存在下被激活，该激活的NifL通过与NifA蛋白相互作用抑制其活性，导致抑制固氮酶和所有其他氮固定所必需的辅助蛋白的形成。

在自养菌、需氧菌、异养菌、固氮的革兰氏阴性土壤细菌属、固氮菌种群中的氮固定是由nifLA操纵子调控的。在此，NifA蛋白也激活所有nif基因的转录，而NifL蛋白对固定的氮和分子氧反应来对抗转录激活因子NifA。固氮菌的nif操纵子的表达由sigma-54转录因子而不是由更常见的sigma-70转录因子调控。sigma-54转录因子的典型特征是需要必须在启动子上游约100或更多个碱基的位置结合至DNA的激活因子。nifA基因存在于固氮菌nifLA操纵子中并位于nifLA操纵子的远端。nifA基因还存在于固氮菌nifLA操纵子中并位于nifLA操纵子的近端。在此，NifL还是负调控因子，其在氧或氨存在下被激活。NifL通过与NifA相互作用使其失效。除了NifA，天然nifLA操纵子的启动子还被氧和氨抑制。nifLA操纵子作为氮固定整个过程的主要调控操纵子。Raina等人[1993,Mol.Gen.Genet.237:400-406]已经充分表征了棕色固氮菌(Azotobacter vinelandii)的nifL基因并已经阐明其调控。与肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的情况不同，棕色固氮菌中nifLA操纵子的表达不是自发调控的。Bali等人[1992,App.Env.Microbiol.58:1711-1718]在棕色固氮菌nifA上游插入了一个抗生素抗性盒并观察到了提高的氮固定和氮排泄。Brewin等人[1999,J.Bacteriol.181:7356-7362]研究了通过插入抗生素抗性盒获得的棕色固氮菌的nifL突变体的铵排泄并推断铵被动地从细胞排泄。在棕色固氮菌中，目前的证据表明NifL通过相对稳定的蛋白质-蛋白质相互作用来控制NifA活性，所述蛋白质-蛋白质相互作用受氧化还原变化、配体结合、和与其他信号转导蛋白和膜组件的相互作用调控。棕色固氮菌NifL包含在组氨酸激酶的递质区域发现的保守组氨酸残基，表明NifL可能使用传统的磷酰基转移机制来将环境信号传达至NifA。然而，用许多其他氨基酸取代这种保守组氨酸不会使信号转导失效。另外，NifL能够在体外ATP不存在下抑制NifA，而信号转导需要两个调控蛋白之间化学计量的蛋白质-蛋白质相互作用(Martinez-Argudo等人，J BacterioL，2004，186(3):601-610)。

在谷类农作物和非谷类农作物中，都需要用工业固定的氮或生物固定氮提供额外的固定的氮以补充土壤中的可用性氮。通过矿化释放到可用池中的氮期望是取决于所收获农产品中移除的土壤氮的量、无机氮(例如，N03'-N)浸析到地下水的量、土壤氮以N₂O或N₂脱氮的量、N固定化的程度和持续时间以及N在土壤生物量中的再活化比例(I.R.Kennedy et al,2004,Soil Biology & Biochemistry 36:1229-1244)。接种生物肥料，特别地，接种固定氮的细菌固氮菌可帮助确保维持有助于最佳产量的营养供应。然而，在化学含氮肥料存在下，没有生物固氮，因为化学肥料产生的铵关闭了nifLA操纵子并因此关闭了随后的所有nif操纵子。