[发明专利]双特异性接头

说明书

本发明涉及将病毒重新导向非病毒特异性宿主细胞的双特异性接头(adapter)，涉及包含具有编码这种双特异性接头的核苷酸序列的DNA分子的表达盒，涉及包含这种表达盒的重组冠状病毒并且涉及它们作为药剂的用途和它们在肿瘤治疗中的用途。

溶瘤病毒用于肿瘤治疗已被研究多年(最近的综述文章参见参考文献[1、2、3、4、5])。它们在摧毁癌症细胞上的成功取决于其选择性地感染和杀死这些细胞的能力。虽然一些溶瘤病毒看起来对肿瘤细胞具有天然的趋向性，但大部分病毒则需要以某种方式被改造以在这些细胞中实现感染和/或溶解活性。实现肿瘤细胞特异性感染的方式之一是将病毒重新导向表达于这样的细胞上的表位。由此，针对各种病毒探索了不同的靶向方法。这些包括假分型、改造病毒表面蛋白和使用双特异性接头(参见下文及[6、7、8])。所有这些方法要求病毒的生存力不受到妨碍并且靶向部分(moiety)适宜地暴露以允许定向感染。所述方法的成功是由基因改造特定病毒的能力，连同合适靶向表位的可用性决定的。

目前为止，仅有几则描述基于冠状病毒的溶瘤剂在癌症治疗中的潜在应用的报道。冠状病毒为由核壳体组成的正义链RNA病毒，其包含大约30 kb的基因组和核壳体(N)蛋白，并且被携带三种膜蛋白：刺突(S)、被膜(E)和基质(M)的被膜所包围。这些蛋白中，刺突糖蛋白S负责病毒进入及合胞体的形成，由于其结合细胞受体并诱导膜融合[9、10、11]。

如由刺突-受体相互作用所决定的，大多数冠状病毒表现出严格的物种特异性[12、13、14]。

例如，冠状病毒猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)通过其受体猫氨基肽酶N (fAPN)选择性地感染并且在猫科细胞中诱导合胞体形成[15]。同样地，重组猫源化(felinized)小鼠肝炎病毒(fMHV) [16]，一种携带嵌合刺突(其胞外域是FIPV刺突蛋白)的小鼠肝炎病毒(MHV)的衍生物，也通过fAPN分子仅仅感染和融合猫科细胞。由于其物种限制趋向性，FIPV和MHV对非猫科细胞或非鼠科细胞分别为非病原性的。然而，一旦趋向性屏障减弱，冠状病毒则可在不同物种的细胞内复制[16、17]。因此，如果其刺突蛋白可识别肿瘤细胞上的受体，FIPV和MHV则可潜在地被转变为用于癌症治疗的特异性溶瘤剂。

非人冠状病毒鼠肝炎病毒(MHV)是研究得最多的冠状病毒，并且更重要的是，一般对于冠状病毒，可获得便利的反向遗传操作系统以改造冠状病毒基因组[16、18]。

像其它冠状病毒一样，MHV具有几个吸引人的特点，可使其适合作为溶瘤病毒。

首先，它具有窄的宿主范围，这是由它的刺突(S)糖蛋白和细胞受体mCEACAM1a之间的相互作用决定的[19]。

由于mCEACAM1a不在非鼠科细胞上表达，MHV不能在正常或者癌变的非鼠科细胞中建立感染。

其次，MHV感染诱导大的多核合胞体形成，其意味着：被感染细胞与周边未感染细胞的融合[11]。因此，还由于其相对较短的复制周期(6至9小时)，一旦它们被感染，MHV就迅速破坏这些细胞群。

再次，MHV的趋向性可通过取代病毒刺突胞外域或使用双特异性接头而改造[20、21、22、23]。

这些双特异性接头为包含病毒结合部分和靶细胞结合部分的蛋白。这种蛋白一方面特异性结合于冠状病毒并且另一方面它们特异性结合于靶细胞上的特异性受体。因此，它们充当了冠状病毒和靶细胞之间的中介物，并因此可将特异冠状病毒重新导向通常不会被该冠状病毒所感染的特异靶细胞。用这种双特异性接头进行的研究揭示，一旦宿主细胞趋向性屏障减弱，比如MHV能够在非鼠科细胞中建立感染。

对于冠状病毒，这种双特异性接头已特别地由Wurdinger描述[22]。这篇论文描述了双特异性单链抗体作为双特异性接头将非人冠状病毒靶向人癌症细胞的用途。这篇论文所用的病毒结合部分源自于针对FIP刺突蛋白产生的抗体而靶细胞结合部分则源自于针对人表皮生长因子受体(EGFR)所产生的抗体。

在Wurdinger的另一篇论文中[21]，描述了另一种双特异性接头，其包含所谓的可溶受体(soR)的MHV细胞受体CEACAM1a的N末端部分(受体突出细胞表面部分的N末端结构域)作为MHV结合部分以及针对人表皮生长因子受体(EGFR)所产生的抗体作为靶细胞结合部分。