[发明专利]使用了嵌入剂的变异基因的识别检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及使用了嵌入剂的基于环杂交法的变异型DNA或野生型DNA的高精度检测方法。

背景技术

近年来，在各种领域中逐渐重视特定基因中的变异的有无。例如，在法医学中的DNA鉴定中，作为个体识别的方法，对由于DNA中的变异或多态性所致的单碱基置换的有无进行确认的做法是众所周知的。另外，在医学领域中还已知在特定的基因多态性与药物敏感性之间具有相关关系，通过调查特定的基因多态性，实现了药害风险的降低。另外，还被用于遗传性疾病的变异型DNA持有者的检测等，基因变异的检测比以前更加重要。

另外，作为基因变异的检测法，已知下述环杂交法(LH法)：其在DNA片段的PCR反应后的反应液中添加单链低聚DNA而与目标DNA片段杂交，根据所得到的杂交体的结构差异用电泳法分离，并根据需要使嵌入剂反应，判断所分离的变异基因(专利文献1、非专利文献1)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2007-61080

非专利文献

非专利文献1：Clinica Chimica Acta,412,1688-1672

发明内容

发明要解决的课题

上述LH法是变异型DNA的检测中有用的方法，但具有难以分离检测碱基数相同的序列的变异型DNA和野生型DNA、或碱基数相同的序列的变异型DNA彼此的问题。因此，本发明的课题在于提高利用LH法得到的变异型DNA与探针的杂交体或/和野生型DNA与探针的杂交体的分离能力。

用于解决课题的方案

鉴于上述状況，本发明人进行了深入研究，结果意外地发现：若使由LH法得到的杂交体与嵌入剂接触并用电泳进行分离，即用电泳对杂交体与嵌入剂的结合体进行分离，则分离能力提高，能够分离检测碱基数相同的序列的变异型DNA和野生型DNA、或碱基数相同的序列的变异型DNA彼此，由此完成了本发明。即，本发明涉及：

“一种变异型DNA或/和野生型DNA的检测方法，其特征在于包括以下的工序(1)～(3)：

(1)使具有置换碱基、缺损碱基区域、或者插入碱基区域的单链DNA(变异型DNA)中的至少1种或/和与其对应的野生型单链DNA(野生型DNA)与和两单链DNA杂交的探针接触，形成与变异型DNA的杂交体(变异型杂交体)或/和与野生型DNA的杂交体(野生型杂交体)的工序(其中，变异型杂交体和野生型杂交体中的至少1种具有环结构)；

(2)使所得到的变异型杂交体或/和野生型杂交体与嵌入剂接触的工序；

(3)对变异型杂交体与嵌入剂的结合体或/和野生型杂交体与嵌入剂的结合体进行分离，从而检测变异型DNA或/和野生型DNA的工序”。

发明的效果

根据本发明的检测方法，由于变异型杂交体与野生型杂交体、或者变异型杂交体彼此的分离能力高，因而即使在变异型DNA与野生型DNA为相同碱基数的情况下，而且即使变异型DNA有复数个且其变异型DNA为相同碱基数的情况下也能够分离识别，其结果，即便是具有各种多态性的变异型DNA，也能够检测变异型DNA和野生型DNA。特别是，在使用电泳法的情况下可显著表现出上述效果。

附图说明

图1是在实施例1中使利用EGFR基因中的野生型DNA(N)和变异型DNA(G1～G5)得到的环杂交反应产物(LH反应产物)在嵌入剂的共存下用微芯片电泳进行分离分析的结果。

图2是在比较例1中使利用EGFR基因中的野生型DNA(N)和变异型DNA(G1～G5)得到的Cy5标记LH反应产物在嵌入剂的非共存下用微芯片电泳进行分离分析的结果。

图3是在比较例2中使EGFR基因中的野生型DNA(N)和变异型DNA(G1～G5)在嵌入剂的共存下用微芯片电泳进行分离分析的结果。

图4是在比较例3中使利用EGFR基因中的野生型DNA(N)和变异型DNA(G1～G5)得到的LH反应产物用凝胶电泳泳动后，添加嵌入剂所测定的分离分析结果。

图5是在比较例4中使利用EGFR基因中的野生型DNA(N)和变异型DNA(G1～G5)得到的Cy5标记LH反应产物在嵌入剂的非共存下用凝胶电泳进行分离分析的结果。

图6是在实施例2中使利用KRAS基因中的野生型DNA(WT)和变异型DNA(G12W)得到的LH反应产物在嵌入剂的共存下用微芯片电泳进行分离分析的结果。