[发明专利]基质干细胞

说明书

引言

本发明涉及分离干细胞的方法，涉及由分离的细胞获得的干细胞群和涉及那些细胞群、由那些细胞群获得的细胞和组织的用途。

背景技术

在20世纪60-70年代，Friedenstein及其同事证明了成骨潜能-由骨髓(BM)细胞的异位移植所揭示-与BM-单核细胞(MNCs)的次要亚群相关(在Friedenstein，1990中综述)。这些MNCs与造血MNC的区别在于它们快速附着到塑料组织培养容器上，以及它们的后代在培养时具有成纤维细胞样外观，暗示着来源于BM的基质区室(stromal compartment)。在建立BM基质源的同时，Friedenstein、Owen及其同事提供了第二个突破，其表明将BM细胞悬液以克隆密度接种会导致单个细胞产生分离集落(colony-forming unit fibroblastic,CFU-F(《成纤维细胞的集落形成单位，CFU-F》)[Friedenstein等人，1970])。

Friedenstein和Owen后来将这种CFU-F形成细胞称为基质干细胞(SSC)(Owen和Friedenstein，1988)，此处提到的SSC基于该原始细胞定义。

BM衍生的SSC可在塑料粘附的(PA)、成纤维细胞的MNC的混合群体中被识别出，所述MNC生成骨、脂肪或软骨以及分泌有效的免疫调节和血管生成蛋白。临床前研究表明，PA-SSC介导体内有效的免疫调节和血管形成应答。目前，临床试验在40种不同的退行性、自身免疫性和缺血性疾病中测试PA-SSC。

在人骨髓中，每80,000个MNC中大约有1个BM单核细胞(MNC)是形成SSC的CFU-F。到目前为止，从BM中分离这些SSC所使用的最简单和频繁的方法取决于之前提到的对组织培养塑料制品的附着，据此，将MNC培养10-14天，在此期间，CFU-F将以认可的1:80000的频率附着和形成集落。在10-14天，通过胰蛋白酶消化收获这些CFU-F，并以3-8000CFU-F/cm²的密度再接种于富血清培养基中。然后，在体外繁殖这些CFU-F，直至获得足够的细胞数量以能够进行生物化学和细胞学评估。这种方法被广泛使用，但是对于临床用途，被认为是不足以定义或纯化SSC的，因为仅有1:80,000接种的BMMNC是SSC，并且这些方法不符合相关产品获得临床批准所需要的药品生产质量管理规范。

因此，现有技术已基于附着到塑料表面的初始能力来鉴别干细胞群。经过这一初始的筛选，从表面的单独集落形成单位获得作为克隆群体的细胞群。尽管该术语可能不准确，但这些在文献中也已被标记为“间充质干细胞”，因为非间充质干细胞可包括在分离的细胞内。在已知的分离方法中，这些已知的细胞群衍生自对碱性磷酸酶(ALP)和CD271呈阳性的干细胞。但是，在临床方面，该细胞基本上未被鉴别。

从这些已知的分离细胞制备(例如从单个分离细胞经克隆扩大)细胞群，并用于移植。但是，结果是变化的，移植的细胞群在批次与批次之间有时表现得相当不同，具有不可预测的因素。

现有技术的细胞群往往形成骨和脂肪及软骨，但经过有限的控制，在需要骨或软骨时，经常形成脂肪。相反，例如，在优选获得形成脂肪的细胞时，却仅仅不可靠地获得这些产生脂肪的细胞。

一个重要的问题是，起始细胞群基本上是未被确定的，因为基于附着塑料的分离不是对细胞类型的充分技术确定。例如，即使以提到的标记物(ALP和CD271)用于选定时，细胞或后代中那些标记物的表达在培养时也会快速消失，留下效果上未确定的群体。细胞的有用性质还会随着时间而减少或消失——未确定的细胞群的另一个问题。

发明目的

本发明的一个总目的是提供分离基质干细胞和细胞群及由其获得的组织的方法，该方法至少是现有技术的一种替代；本发明特定实施方式的一个目的是提供改进的方法，例如通过增强所获细胞的确定，或提供改进的细胞或组织，例如通过增强其性质的可靠性，使它们更适合临床应用。

发明内容

本发明基于基质干细胞特别是人基质干细胞的预期分离，基于在多种哺乳动物中表达的标记物或抗原的表达。在本发明的方法和细胞群中，细胞基于特定的跨物种标记物的表达来进行分选，这被称为预期分离，然后培养获得的细胞，留至细胞鉴别，即可克隆扩增的成纤维细胞的集落形成单位(CFU-Fs)。克隆扩增后获得的细胞群接着计划用于治疗、移植和其它用途。