[发明专利]NPRCP、PFDNC和它们的应用

说明书

相关申请的引用

本申请要求于2012年2月13日提交的美国临时申请号US 61/598,069的优先权，将其全部内容通过引用结合在此。

技术领域

本发明的实施方式涉及高度再生的哺乳动物颗粒组合物和它们的组装产品。

背景技术

对于再生药物研究中的核心挑战是开发其可以有助于重构受损的组织和器官的细胞组合物。用于使受损的组织再生或修复的方法可以用于解决特征在于特定的细胞类型或具有多种细胞类型的组织缺失或缺陷的多种疾病、病症和损伤。这类细胞缺失可以与创伤、缺血性损伤、代谢性疾病、或退行性病症相关。通常使用器官移植来替换受损或患病的组织。遗憾的是供体器官来源有限。即使当有可用的供体器官时，还会发生排斥移植的生物材料。用于细胞治疗的干细胞也诱导排斥，并且因此必须检测来自供体和受体的血液用于组织配型。

发明内容

提供该发明内容来呈现本发明的概述以简要地指出本发明的本质和性质。提交该发明内容应理解，其将不会用于解释或限制权利要求的范围或含义。

本发明的实施方式特别地涉及哺乳动物非血小板包含RNA的颗粒(哺乳动物包含RNA的非血小板颗粒，mammalian non-platelet RNA-containing particles，NPRCP)的分离、培养和应用，以及由NPRCP组装的颗粒融合物衍生的无核细胞(particle-fusion-derived non-nucleated cells，PFDNC)(ATCC专利保藏名称：PTA-13396)。

NPRCP包含小RNA(small RNA)和蛋白质并且具有约0.1μm至约10μm的直径，并且由薄膜包围。NPRCP是包含蛋白质、小RNA和微小RNA(microRNA)的小囊泡，并且从小于约1μm生长最高达约7μm。通过从薄膜外摄入营养和颗粒，尺寸可能增加。

在优选的实施方式中，识别出至少5种类型的不同的NPRCP(图2-6)。它们被列出为：1)包含大的核心样颗粒(微粒、粒体、粒质，granulose)类型的颗粒(particle)(图2)。这个类型的颗粒包含大的核颗粒(nuclear granule)(箭头)。这些核颗粒具有致密的核样结构并且尺寸不同(0.1–0.5μm)。该类型NPRCP的尺寸范围为2μm至5μm。2)松散膜类型。这个类型的颗粒在外部具有极薄的膜并且在膜内包含分散的致密核颗粒。它们在内部还具有分层的结构。由于膜结构的柔韧性，它们的形状可以是非常不同的。3)固体颗粒类型。这个类型的颗粒不具有松散膜。它们包含小的颗粒、致密的核物质和低致密区域。它们是圆形。大部分的核颗粒定位于颗粒的一边(见4-5μm)或在膜下。4)致密物质类型。这个类型的颗粒包含均匀分布于该成分中的致密物质。在膜下面可以看见一些核颗粒。此外，它们的膜是厚的并且具有不规则突起。5)均匀并且非致密类型。这个类型的颗粒包含均匀分布于该成分中的小的核颗粒和纤维样结构。这些颗粒是具有薄膜的圆形。

在优选的实施方式中，除了小RNA和微小RNA外(图7)，NPRCP表达包含CD29(整联蛋白β1)、CXCR4、c-kit、CD45、CD34、肌动蛋白或它们的组合(图8A-图8D至图10)的表面标志物。在它们的成分中，它们还包含DDX4/VASA、Oct4、sox-2和微管蛋白(图8A-图8D)。

在另一优选的实施方式中，少于5％的分离NPRCP在表面表达E-钙粘蛋白。

在实施方式中，从较大尺寸的表达Oct4的无核前细胞(pre-cell)释放NPRCP(图13、图15、图16)，然而，这些前细胞可以分化为有核(nucleated)细胞，其依赖于它们的分化阶段(图15左，图17)。识别出至少两种不同的释放NPRCP(NPRCP-releasing)的前干细胞(图13)。这些前干细胞不具有不同的细胞质成分，并且也不具有不同的细胞核。它们可以释放几百个小尺寸的NPRCP，其在细胞外环境中通过采集循环的微小RNA、小RNA和蛋白质可以进一步变得更大。这些释放NPRCP的前干细胞，在培养的条件下，其特征在于由不同尺寸的大量NPRCP围绕的小的细胞结构(图17)。然而，在血液中，释放NPRCP的前细胞被表征为不具有细胞核的纺锤形或圆形细胞结构(图13中的箭头)。

在实施方式中，NPRCP包括至少3种不同的形状：纺锤形、圆形和短杆形(图14)。