[发明专利]HEV测定

说明书

本发明涉及用于检测HEV感染的诊断试验，引物组，寡核苷酸组和试剂盒。

HEV感染引起戊型肝炎(hepatitis E)，一种急性病。HEV是无包被的、单链、正义RNA病毒，其属于肝病毒科(Hepeviridae)。引起人类感染的有四种主要的基因型，基因型1,2,3和4。HEV诊断试验对于已经排除了引起急性肝炎的其他因素的人们而言至关重要。

HEV的不同区域已在基于核酸的HEV试验设计中应用。通常使用HEV的ORF2和ORF3，通过核酸扩增检测HEV。JP04080995和JP04127722中提议将具有多简并位点的简并引物用于嵌套引物扩增法，所述方法基于部分定位于HEV的5’UTR区的引物的。

发明概述

本发明涉及同时扩增可能存在于生物样品中的HEV基因型1,2,3和/或4的方法，该方法包括步骤：

(a)分离生物样品中的核酸；

(b)利用一种非-简并正向引物和至少一种非-简并反向引物扩增步骤(a)中分离的核酸，其中，所述的正向和反向引物能扩增HEV的基因型1,2,3和4，

其中，所述正向引物的核酸序列包含Seq ID NO:6，所述的一种或以上反向引物的核酸序列包含选自SEQ ID NO:7-14的序列。

一方面，本发明涉及引物组，其包括正向引物和至少一种反向引物，其中，所述正向引物的核酸序列包含SEQ ID NO:6，其中至少一种反向引物的核酸序列，或所述反向引物选自SEQ ID NO:7-14。

一方面，本发明涉及寡核苷酸组，其中，所述组由上述的引物组和一种探针组成，其中，所述的探针包含SEQ ID NO:15-19或其互补序列的至少20个连续的核苷酸。

一方面，本发明涉及上述的引物组或寡核苷酸组在同时检测可能存在于生物样品中的基因型1,2,3和/或4中的用途。

一方面，本发明涉及试剂盒，其包含依赖模板的DNA聚合酶，核苷酸，以及上述的引物组或寡核苷酸组。

附图简述

图1提供由液体样品分离核酸的工艺流程。

发明详述

本发明涉及同时扩增可能存在于生物样品中的HEV基因型1,2,3和/或4的方法，该方法包括步骤：

(a)分离生物样品中的核酸；

(b)利用一种非-简并正向引物和至少一种非-简并反向引物扩增步骤(a)中分离的核酸，其中，所述的正向和反向引物能扩增HEV的基因型1,2,3和4，

其中，所述正向引物的核酸序列包含Seq ID NO:6，一种或以上反向引物的核酸序列包含选自SEQ ID NO:7-14的序列。

在一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列包含Seq ID NO:6，所述的至少一种反向引物的核酸序列选自SEQ ID NO:7-14。在另一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列包含SEQ ID NO:6，所述两种反向引物的混合物的核酸序列包含SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14。在另一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6组成，所述反向引物的核酸序列包含SEQ ID NO:7。在另一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6组成，所述反向引物的核酸序列包含SEQ ID NO:13。在另一个具体实施方案中，所述正向引物的核酸序列由SEQ ID NO:6组成，所述反向引物的核酸序列包含SEQ ID NO:11。

本发明的方法的有益之处在于，能够在单一反应中同时、有效地扩增HEV的基因型1,2,3和4。

一个具体实施方案中，所述核酸通过结合于固相被分离。

一个具体实施方案中，所述方法还包括使经扩增的核酸与探针在足以使得所述的探针结合于经扩增的核酸的条件下接触。在一个具体实施方案中，所述的探针包含SEQ ID NO:15-19或25的核酸序列或其互补序列的中的至少22-35个连续的核苷酸。在一个具体实施方案中，所述探针的核酸序列由选自SEQ ID NO:15-19或25或其互补序列的序列组成。在一个具体实施方案中，所述探针的核酸序列由选自SEQ ID NO:15-18或25或其互补序列的序列组成。在一个具体实施方案中，所述的探针包含与所述探针的5’端偶联的荧光团，和猝灭剂，其中，所述的荧光团和猝灭剂之间的间隔包含至少9个核苷酸。