[发明专利]制备表面活性肽的方法

说明书

本发明提供基于重组DNA技术制备表面活性物质-蛋白C肽(SP-C肽)的方法。本发明还提供用于该方法的基因构建体、载体和宿主细胞。

发明背景

肺表面活性物质减少肺泡内侧的气液交界面上的表面张力，防止肺在呼气结束时塌缩。

表面活性物质缺乏是早产儿的一种病症，引起呼吸窘迫综合征(RDS)，可以用从动物肺提取的天然表面活性物质对这种病症进行有效治疗(参见Fujiwara,T.和Robertson B.(1992)于:Robertson,B.,van Golde,L.M.G.和Batenburg,B.(编著)Pulmonary Surfactant:From Molecular Biology to Clinical Practice Amsterdam,Elsevier,pp.561-592)。

这些表面活性物质制剂的主要成分是磷脂如1,2-二棕榈酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱(DPPC)、磷脂酰甘油(PG)和疏水表面活性蛋白B和C(SP-B和SP-C)。

蛋白SP-B和SP-C仅构成表面活性物质质量的大约1-2％，但是与纯的脂类制剂相比，仍然能极大地改善表面活性(参见Curstedt,T.et al.(1987)Eur.J.Biochem.168,255-262；)。

SP-C是脂蛋白，由35个氨基酸残基组成，在残基9-34之间具有α-螺旋域(参见Johansson,J.et al.(1994)Biochemistry 33,6015-6023)。

该螺旋主要由缬氨酰-残基组成，镶嵌在脂双层中，其方向与脂酰链平行(参见Vandenbussche,et al.(1992)Eur.J.Biochem.203,201-209)。

两个棕榈酰基团与该肽的N-末端部分的位置5和6的半胱氨酸残基共价连接(参见Curstedt,T.et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87,2985-2989)。

位置11和12上的两个保守的带正电荷残基，可能与脂膜的带负电荷的头部基团相互作用，从而增加其刚性。

趋向C-末端，脂-肽相互作用的刚性减少，因为它仅含有小的疏水性残基，使得这部分在磷脂双层中可能更具有柔性。

由于从动物组织中获得的表面活性物质制剂可能表现出某些缺点，如它们获得的量有限以及它们可能含有致病原以及诱导免疫反应，已经尝试创造通常由合成脂类和合成的SP-C和/或SP-B蛋白类似物组成的人工表面活性物质。

但是，对于合成的SP-C蛋白而言，先前的工作已证明它可能不能像天然肽那样折叠成最佳表面活性所需要的α-螺旋构象(参见Johansson,J.et al.(1995)Biochem.J.307,535-541)，因此可能不能与表面活性脂类正确地相互作用。

为了避免这个问题，已进行了几种尝试来改变序列，例如将天然SP-C中所有的螺旋Val残基替换成Leu，Leu强烈地有助于形成α-螺旋构象。相应的跨膜类似物，SP-C(Leu)当与适当的磷脂混合物组合时，在气-液交界面上表现出良好的延展。

WO 2008/044109公开了SP-C蛋白的肽类似物，被称为SP-C33(Leu)，其具有下述的单字母氨基酸序列

IPSSPVHLKRLKLLLLLLLLILLLILGALLLGL(SEQ ID NO:1)。

该肽可以通过合成方法来制备。传统的合成方法在例如Schroeder et al.,‘The peptides’,vol.1,Academic Press,1965；Bodanszky et al.,‘Peptide synthesis’,Interscience Publisher,1996；Baramy&Merrifield,‘The peptides；Analysis,Synthesis,Biology’,vol.2,chapter 1,Academic Press,1980中描述。

所述技术包括在固相中、溶液中进行肽合成，有机化学合成方法，或它们的任何组合。

通过传统技术进行的合成肽如肽SP-C33(Leu)的产生受到它们的高疏水特性的影响，从而限制了它们的水溶性。

所述缺点通过本发明的方法被克服。

定义