[发明专利]基于探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验的从靶核酸序列的核苷酸变异检测

权利要求书

1.一种利用探测和标记寡核苷酸切割及延伸试验来从靶核酸序列检测核苷酸变异的方法，其包括：

步骤(a)，使上述靶核酸序列与上游引物以及探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异进行杂交；

上述上游引物包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列；

上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异包含：

(i)3’-靶向部位，包含与上述靶核酸序列互补的杂交核苷酸序列，

(ii)5’-标记部位，包含与上述靶核酸序列非-互补的核苷酸序列，以及

(iii)核苷酸变异区别位点，包含与上述靶核酸上的核苷酸变异互补的序列，并位于上述3’-靶向部位的5’-末端一部分，其中所述核苷酸变异区别位点位于离上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端10个核苷酸以内的位置；

上述3’-靶向部位与上述靶核酸序列杂交，上述5’-标记部位不与上述靶核酸序列杂交；

上述上游引物位于上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的上游；

上述上游引物的延伸链诱导基于具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶的探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异切割；

步骤(b)，在用于切割上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的条件下，使上述步骤(a)的结果物与具有5’核酸酶活性的模板-依赖性核酸聚合酶相接触；若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述核苷酸变异区别位点互补的核苷酸变异的上述靶核酸序列进行杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分与上述靶核酸序列形成双链，从第一初期切割位置诱导切割，则放出第一片段；若上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异与具有对上述核苷酸变异区别位点非互补的核苷酸变异的靶核酸序列进行杂交，且上述3’-靶向部位的5’-末端一部分不与上述靶核酸序列形成双链，而从位于上述第一初期切割位置的下游的第二初期切割位置诱导切割，则放出第二片段；上述第二片段包含追加的3’-末端部位，用于使上述第二片段与上述第一片段不同；

步骤(c)，使从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述片段与捕捉和模板化寡核苷酸进行杂交；

上述捕捉和模板化寡核苷酸沿着3’→5’方向包含：

(i)捕捉部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位或5’-标记部位的一部分互补的核苷酸序列，以及

(ii)模板化部位，包含与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的5’-标记部位及3’-靶向部位非-互补的核苷酸序列；

从上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异放出的上述第一片段或上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交；

步骤(d)，利用模板-依赖性核酸聚合酶及上述步骤(c)的结果物来实施延伸反应；若上述第一片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则上述第一片段被延伸，来生成包含与上述捕捉和模板化寡核苷酸的模板化部位互补的延伸序列的延伸链，若上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位杂交，则上述第二片段不被延伸；以及

步骤(e)，检测上述延伸链的存在，上述延伸链的存在表示与上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的核苷酸区别位点互补的核苷酸变异的存在。

2.根据权利要求1所述的方法，其中上述第二片段与上述捕捉和模板化寡核苷酸的捕捉部位进行杂交的情况下，上述捕捉和模板化寡核苷酸不与上述第二片段的上述追加的3’-末端部位进行杂交，上述捕捉和模板化寡核苷酸具有为了防止上述第二片段的延伸而被选择的序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其中上述探测和标记寡核苷酸-核苷酸变异的3’-靶向部位的5’-末端一部分包含位于离上述核苷酸变异区别位点1至5个核苷酸以内的位置的非-碱基对部分，上述非-碱基对部分增加上述第一初期切割位置及上述第二初期切割位置之间的差异。

4.根据权利要求3所述的方法，其中上述非-碱基对部分扩大上述第一初期切割位置及上述第二初期切割位置之间的距离。

5.根据权利要求3所述的方法，其中上述非-碱基对部分是以下内容：

(i)包含人为错配碱基、变形为无法碱基配对的非-碱基对碱基或通用碱基的核苷酸，或

(ii)变形为无法碱基配对的非-碱基对核苷酸。

6.根据权利要求3所述的方法，其中上述非-碱基对部分是非-碱基配对化合物。

7.根据权利要求3所述的方法，其中上述非-碱基对部分具有1至5个部分。