[发明专利]使用合成的信使RNA无饲养细胞地衍生人类诱导性多能干细胞

说明书

本公开总的来说涉及使用工程化的重编程因子通过动力学受控过程产生诱导性多能干细胞(iPSC)的新方法和组合物。具体来说，本公开涉及建立被优化用于重编程各种不同类型细胞的重编程因子的组合，包括常规重编程因子与反式激活结构域之间的融合体。更具体来说，本文中公开的示例性方法可用于从各种不同的哺乳动物细胞类型、包括人类成纤维细胞产生诱导性多能干细胞。还公开了使用合成的信使RNA无饲养细胞地衍生人类诱导性多能干细胞的示例性方法。

相关申请

本申请要求2012年5月13日提交的美国临时申请USSN 61/646,292的优先权利益，其内容整体并入本文。

发明领域

本公开总的来说涉及使用工程化的重编程因子通过动力学受控过程产生诱导性多能干细胞(iPSC)的新方法和组合物。具体来说，本公开涉及建立被优化用于重编程各种不同类型细胞的重编程因子的组合，包括常规重编程因子与反式激活结构域之间的融合体。更具体来说，本文中公开的示例性方法可用于从各种不同的哺乳动物细胞类型、包括人类成纤维细胞产生诱导性多能干细胞。还公开了使用合成的信使RNA无饲养细胞(feeder-free)地衍生人类诱导性多能干细胞的示例性方法。

背景技术

下面包括了可用于理解本公开的各个方面和实施方式的信息。这并不是承认这里提供的任何信息是本文中描述或要求的发明的现有技术或与其相关，或者任何明确或隐含地参考的出版物或文献是现有技术。

诱导性多能干细胞(iPSC)的治疗潜力，刺激了避开对体细胞进行遗传修饰以引起向多能状态的重编程的需要的重编程方法的开发尝试。就此而言获得成功的第一种“非整合”方法——蛋白质转导、质粒转染和腺病毒载体的使用，由于获得的iPSC转化的效率低而在应用上受限。更近些时候，已显示利用游离体DNA、仙台病毒和合成的信使RNA(mRNA)的技术，以与使用整合病毒载体所获得的效率可比或更高的效率产生“无足迹”iPSC。在原理上，RNA转染是这些方法中最具吸引力的，因为它对重编程因子(RF)表达的时间过程提供精确控制，同时完全避免了对“清除”重编程的细胞以除去载体的残留痕迹的任何需要。然而，基于mRNA的重编程的现有流程，由于在人类细胞中诱导多能性所需的～2周时间内需要每日进行重复转染，因此是相对劳动密集的。这些程序也依赖于饲养细胞的使用，为方法增添了复杂性和技术可变性，同时引入了具有非人类来源的(“外来的”)生物材料的潜在污染源。

生产诱导性多能干细胞(iPSC)的主要难点是将分化的细胞重编程成多能细胞的低效率。以前已报道，当用由Oct4和MyoD的反式激活结构域构成的融合基因(被称为M₃O)以及Sox2、Klf4和c-Myc(SKM)转导时，5％的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)被重编程成iPSC。此外，M₃O在大多数被转导的MEF、包括没有变成iPSC的细胞中促进了多能性基因的染色质重塑。这些观察表明了在提供更有利的培养条件的情况下，超过5％的细胞获得了变成iPSC的能力的可能性。

发明概述

因此，为了应对这些缺点，本公开提供了用于产生干细胞的方法和组合物，所述干细胞能够产生人体的所有不同组织。在某些情况下，使用信使RNA分子并且不需病毒载体、动物产物或饲养细胞，本文公开的方法可用于将人类成纤维细胞重编程成诱导性多能干细胞(iPSC)。所述示例性方法和组合物的使用导致与以前报告的细胞重编程方法相比，效率惊人且出人意料地提高。

因此，提供了通过改进重编程因子(RF)混合物，尤其是通过使用并入了已知的强转录因子例如VP16和MyoD的反式激活结构域的常规重编程因子例如Oct4(也称为Oct3/4)、Sox 2等的工程化变体而可用于加速mRNA介导的重编程的方法、试剂和/或组合物。本文中公开的方法和组合物产生了无饲养细胞、无外来物的方案，其极大减少了基于mRNA的重编程中所涉及的时间、成本和工作量。