[发明专利]制备单供体凝血酶血清的方法和装置

说明书

相关申请

本专利申请是于2012年9月25日提交的美国临时专利申请61/705,535的非临时申请，并要求该专利申请的优先权，该专利申请的全部内容并入本文而形成一体的文件。

技术领域

本发明涉及血液中的凝血酶原向凝血酶的转化，尤其涉及一种用于提高血液中的活化级联凝血蛋白的浓度的装置和方法。

背景技术

血浆凝结被认为是通过一系列的自我扩增型酶原-酶转化(图1)发生的，在这种转化过程的倒数第二步中产生凝血酶(FIIa)，凝血酶是一种强大的丝氨酸蛋白酶。在被称为“凝血级联”的最后步骤中，凝血酶原被称为凝血酶原酶复合物的含钙多蛋白复合物转化为凝血酶。凝血酶是一种酶，它把纤维蛋白原水解为血纤维蛋白单体，这些血纤维蛋白单体聚合为细网状，而这种细网又使血浆形成凝胶或凝块。凝血酶是胰蛋白酶族的丝氨酸蛋白酶，其分子量约为34kDa。它由两个多肽链构成。

凝血级联过程通常分为两个分支，以便论述和进行凝血障碍试验。内源性分支和外源性分支可分别强化，但可合并为一条引生凝血酶的公共途径。外源性途径负责止血控制，并对血管受伤做出响应。当血液与促凝物质接触时，内源性途径开始发挥作用，导致XII因子活化。在《J Biomed Mater Res.(生物医学材料研究学报)》1995年8月刊的29(8):1005-16部分和29(8):1017-28部分中，对促凝物质对凝血的接触活化作用进行了深入研究，这些文献的完整内容通过引用结合于此。

促凝物质指使血液形成凝血酶调节蛋白凝块的任何元素或活性物质。促凝剂包括各种带负电荷的表面，包括高岭土、棉花、陶瓷、玻璃、鞣花酸等有机和无机材料。促凝剂已知可单独使用或联合使用。

与这些带负电荷的表面结合会引起XII因子(FXII)发生构造变化，从而能够以蛋白水解的方式活化前激肽释放酶(PK)。PK以蛋白水解的方式活化FXII，从而形成一个正反馈回路，该正反馈回路使系统增强，并在激肽释放酶的作用下导致FXI活化和高分子量激肽原(HK)解理。

促凝物质的XIIa因子活化作用的后续产物是形成凝血酶原酶复合物，该复合物由丝氨酸蛋白酶、Xa因子、蛋白辅助因子、以及Va因子构成。在钙离子存在的条件下，该复合物聚合在带负电荷的磷脂膜上。向柠檬酸盐抗凝血液添加钙盐以使凝血级联过程继续进行常常被称为复钙。凝血酶原酶复合物催化从凝血酶原(II因子，一种不活跃的酶原)向凝血酶(IIa因子，一种活跃丝氨酸蛋白酶)转化的过程。虽然实验表明Xa因子在不与凝血酶原酶复合物结合时可活化凝血酶原，但是在这种情况下凝血酶形成速率会显著降低。

在正常血液中循环的重要凝血因子的浓度比种类繁多的其它血液蛋白(其中大约有490种，其浓度差异超过60倍)的浓度低得多。在许多未解决的问题中，一个问题是，白蛋白、纤维蛋白原或IgG等高浓度血液蛋白由于什么机制未能与活化复合蛋白在由血液浓度低得多的蛋白质所构成的促凝表面上的聚合(称为“吸附-稀释”效应)竞争。在2007年10月刊的《Biomaterials(生物材料学报)》的28(30):4355-4369页上，周氏等人揭示了：在始终存在活化表面的条件下，FXIIa在全血浆中的积聚速率会随时间而降低，从而导致FXIIa的产生量趋于稳态，该产生量取决于悬浮在血浆中的促凝微粒的初始FXII溶液浓度。该文献的完整揭示内容通过引用结合于此。作者解释说，这个结果有力地表明活化作用与自动抑制作用竞争，在自动抑制作用中，FXIIa本身抑制FXII→FXIIa。在2009年4月刊的《Biomaterials(生物材料学报)》的第30(10)：1857-1869页上，埃尔温A.福格尔和克里斯多佛A.谢德莱茨基全面考查了接触活化凝血化学过程(包括自动活化、自动水解和自动抑制反应)中存在的其它不确定性。参见图1。

凝血酶原酶复合物的聚合从Xa因子和Va因子结合到血浆膜上的带负电荷的磷脂上时开始。在结合到血浆膜上后，Xa因子和Va因子迅速地按1：1化学计量比联合，从而形成凝血酶原酶复合物。凝血酶原酶复合物的聚合取决于钙。完全聚合后的凝血酶原酶复合物会催化凝血酶原向丝氨酸蛋白酶凝血酶的转化。当与凝血酶原酶复合物联合时，Xa因子的催化效率会提高300000倍。