[发明专利]用于瞬时转染完整植物的农杆菌

说明书

发明领域

本发明涉及瞬时转染植物或植物上的叶的方法。本发明还涉及在植物中或在植物上的叶中瞬时表达目的DNA序列的方法。另外，本发明涉及农杆菌(Agrobacterium)菌株。

发明背景

用于农业的当前基因工程方法均基于1983年首次阐明(Fraley等人1983；Barton等人1983)并自1996年商业化的作物物种的稳定基因修饰。尽管基于植物稳定遗传转化的农业方法如今是现实并且是成功新实践的基础，但它具有多种限制，主要限制是开发转基因作物所需的时间很长和成本高昂。参与植物生物技术的公司之间的一般共识是取决于作物物种，研发过程需要8–16年，并且平均开发总成本估计在一亿和一亿五千万美元之间。因为这些限制，自从发现植物遗传转化方法以来超过25年后，仅少量性状和少数GM作物物种迄今已商业化。

已知也可以使植物细胞和全株植物短暂再编程(即，没有新遗传物质稳定整合在植物染色体上)，并且瞬时方法例如病毒感染快捷。此类瞬时方法原则上可以允许非常快速地调节植物代谢，有利于用户感兴趣的某些产物。此类方法要求已经被工程化以有效和安全地转染植物的DNA或RNA载体(病毒或细菌)。早期尝试使用基于植物病毒的载体已经部分获得成功，在于它们允许转染植物以制造高价值的重组蛋白质，例如某些生物药(Gleba等人2007，2008；Lico等人2008)。文献中已经描述利用病毒操纵其他性状例如输入性状(例如除草剂抗性，Shiboleth等人2001；Zhang和Ghabiral 2006)，但病毒转染在感染的宿主中引入如此多不想要的变化，从而不再继续寻求这类瞬时方法用于输入性状。瞬时方法还可以围绕农杆菌(Agrobacterium)物种将其Ti质粒的部分转移给真核细胞(特别是植物细胞)的能力进行构建。使用基于农杆菌的转染是用于遗传操纵例如遗传转化方案和实验室瞬时转染试验的基础。基于农杆菌的转染的工业应用也局限于重组蛋白质制造，原因是最佳应用条件(例如用细菌悬液对植物的真空渗入)不能在田间大规模使用，而用细菌溶液喷洒地上部分或浇灌植物导致转染据推测非常小部分的植物细胞，并且先前研究根本未解决这个具体问题。

根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)和发根农杆菌(A.rhizogenes)在世界上广泛用于研究实验室中，用于植物的瞬时转染和稳定遗传转化。这些应用基于农杆菌将遗传信息转移给真核细胞的能力。目前培养的许多转基因植物例如大豆、卡诺拉油菜和棉，通过农杆菌介导的遗传转化产生。在瞬时转化和稳定转化之间的本质差异是：在稳定转化的方法中，农杆菌递送的DNA最终整合到植物染色体中，并且随后由植物子代继承。此类整合事件甚至在专门设计以提供植物细胞和细菌之间大量接触的实验室实验中是稀有的；因此为了选择稳定转化体，不得不利用专用选择性筛选方法并且使用为最佳转化和再生成完整植物而选择的特定植物外植体(富含分生组织)。因此，在这个科学领域积累的知识对于对瞬时方法有兴趣的那些人而言价值有限，在瞬时方法中应影响植物体的许多细胞，但不选择被转染的细胞。

另一方面，瞬时转染仅考虑农杆菌驱动的向植物细胞核递送DNA的早期步骤以及下述事实：此类递送的DNA分子可以在胞核中转录，甚至在DNA不整合到植物染色体的情况下，这种表达导致植物细胞的瞬时代谢性再编程。已经将这种再编程开发成用于快速评价不同遗传实验的实验工具。尽管存在关于农杆菌介导向植物细胞转移DNA的大量知识，但是这种信息总是限于实验室规模的实验，并且因而迄今为止，极少尝试开发涉及农杆菌作为DNA载体的工业规模应用。