[发明专利]用于量化样品中核酸序列的组合物和方法

说明书

本发明特征在于用于实时地定量检测样品中的靶寡核苷酸的组合物和方法。这些方法与使用NEAR反应扩增靶寡核苷酸是相容的。

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年4月9日提交的美国临时申请号61/621,975的权益，所述申请通过引用以其全文结合在此。

发明背景

核酸扩增技术已经提供了理解复杂生物学过程，检测、鉴定、和量化病原性和非病原性有机体，法医犯罪学分析，疾病相关研究，以及遗传上修饰过的有机体中的事件的检测等的手段。聚合酶链式反应(PCR)是用于扩增DNA的常用热循环依赖性核酸扩增技术，所述技术由多个循环的、用于DNA熔化和使用DNA聚合酶的DNA的酶复制的反应的重复加热和冷却组成。实时定量PCR(qPCR)是用于量化生物样品中给定核酸序列的拷贝数的技术。目前，qPCR利用了贯穿所述反应的实时反应产物检测，并且比较扩增图谱与在每个反应开始时包含已知量的核酸(或核酸与未知的所测试的核酸的已知相对比率)的对照的扩增。对照的结果用于构建标准曲线，典型地基于标准反应扩增曲线的对数部分。基于与标准对照量进行比较的它们的扩增曲线的情况，这些值用于插入未知物的量。

除了PCR，现存的非热循环依赖性扩增系统或等温核酸扩增技术包括但不局限于：切口和延伸扩增反应(NEAR)、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)、自动维持序列扩增(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、单引物等温扩增(SPIA)、Q-β复制酶系统、以及重组酶聚合酶扩增(RPA)。

NEAR扩增具有与PRC热循环的相似性。类似于PRC，NEAR扩增采用与PCR中称为引物并且在NEAR中称为模板的靶序列互补的寡核苷酸序列。此外，靶序列的NEAR扩增导致靶序列的对数增长，就像它在标准PCR中的表现一样。不像PCR，NEAR反应是等温地进展。在标准PCR中，温度是增加的，用来允许两个DNA链分开。在NEAR反应中，靶核酸序列在测试样品中存在的特异性切口位点处是切口的。聚合酶渗入切口位点并且与现存互补DNA链的置换一起开始切口的靶核苷酸序列(添加的外源DNA)的互补链合成。链置换复制过程排除了对增加的温度的需求。此时，模板/引物分子从添加的外源DNA退火成置换的互补序列。聚合酶现在从模板的3’端延伸，产生先前置换的链的互补链。然后第二模板/引物寡核苷酸退火成新合成的互补链并且延伸，制成包括切口酶识别序列的NDA的双链体。所述链然后倾向于被切口，伴随通过聚合酶的随后的链置换延伸，这导致在原有靶DNA的任一侧上具有切口位点的DNA的双链体的产生。一旦这被合成，继续通过置换的链与新模板分子一起的复制指数地扩增所述分子。此外，还通过在模板引入的切口位点的切口翻译合成的重复动作，扩增从每个产物分子线性地继续进行。结果是靶信号扩增的非常迅速的增长；与PCR热循环相比，远远更快，其中扩增导致小于十分钟。

然而，量化已经成了问题。实时NEAR系统的最佳性能取决于特异性产物的产生和扩增。已知除了通过反应酶的特异性产物，NEAR系统产生显著水平的非特异性背景产物。这些背景产物可以用作可扩增实体，并且它们的产生会胜过特异性产物的产生。虽然可能设计特异性针对希望的靶的检测探针(并且因此在复杂背景中，特异性产物是可检测的)，但是显著水平的非特异性背景产物隔离了可能已经另外用于特异性产物的扩增的反应组分。因此，由于非特异性背景产物产生引起的反应组分隔离导致次优的反应。当靶核酸最初处于非常低的丰度时，并且在靶的可靠检测需要高度优化的反应的情况下，这是特别麻烦的。而且，次优的反应不会表示靶核酸的真实量化，即使它是可检测的。会有利的是，产生消除非特异性背景产物的扩增的优化的NEAR反应。这样做会通过基于标准曲线的系统抑或相对量化，提供适合量化的反应。

而且，通常的做法是使用质谱法来评价NEAR反应。高水平的背景产物会模糊质谱法数据的判读。例如，如果反应包含背景产物、源自非特异性扩增(来自仍相关的不相似的靶)的一种或更多种产物、以及特异性产物，则从背景产物鉴定这些基质衍生的产物将是挑战性的。背景产物的消除导致具体测定的性能/特异性的清晰确定。