[发明专利]啤酒花品种的识别方法

说明书

技术领域

本发明涉及利用了由品种间不同的至少一个单核苷酸多态性构成的识别标记的用于识别啤酒花品种的方法以及该识别标记的制备方法。

背景技术

啤酒花(学名：Humulus lupulus)为属于大麻科的雌雄异株的蔓性(攀援)植物。雌株具有称为“球花”的像松果形的花的结构，该球花为啤酒的原料。未受精的球花中，有称为蛇麻素的黄色颗粒，其为啤酒独特的香味、清爽苦味的来源。啤酒花具有赋予啤酒略带苦味、爽快的香味、提高泡持性、使啤酒的光泽(色泽)良好、抑制杂菌繁殖的作用，是啤酒酿造中不可缺少的原料之一。

啤酒花在以德国、美国为首的捷克、英国、法国、中国、斯洛文尼亚、南非、澳大利亚、新西兰、日本等国栽培，其栽培品种也多种多样。啤酒花品种中有香型啤酒花和苦型啤酒花。香型啤酒花为赋予芬芳香味和温和苦味的啤酒花，苦型啤酒花为赋予具有收敛性的苦味的啤酒花。如此，啤酒花因各品种的香味、味道不同，所以在酿造高品质的啤酒时，筛选符合目的的啤酒花品种非常重要。而且，为了稳定维持其品质，准确检查所订购的原料啤酒花是否能正确进货非常重要。至今为止，根据供货商所提供的品质保证书、蛇麻素中所含有的α酸等成分含量的不同、球花外观上的差异进行确认。但是，在日本，通常是购入将啤酒花的球花干燥、粉碎、压缩整形制成颗粒状的啤酒花来用于啤酒酿造。因此，很难从球花外观上的特征来识别品种。此外，从球花中得到的苦味成分、精油成分等的化学成分也易受环境因素的影响，还有因品种关系而显示近似值的啤酒花等，所以作为识别的指标具有局限性。

另一方面，近年来，开发了一些应用基因工程的品种识别方法。这些方法通过检测品种间碱基序列的不同，即检测多态性来进行品种识别。啤酒花中，国际公开公报(WO 1997/005281)中公开了以下方法，通过RAPD(随机扩增多态性DNA)法寻找品种间不同的DNA区域，设计可扩增该区域的引物，通过使用该引物的PCR来扩增多态性区域，通过分析扩增片段的有无或其大小的差异来识别啤酒花品种，此外，日本特开平11－103895公报中公开了以下方法，通过使用高浓度的氯化锂，从啤酒花中高效提取·纯化适合PCR的基因组DNA，相对于该基因组DNA使用随机引物、STS(序列标签位点)标记的引物等的引物进行PCR，扩增可识别啤酒花品种的DNA，通过扩增DNA的有无来判别啤酒花品种，而且，日本特开2006－34142公报中还公开了以下方法，通过使用设计成可扩增包含品种间多态性的微卫星区域的引物来进行PCR，扩增微卫星DNA，通过分析扩增DNA片段长度的差异来识别品种。

通过利用啤酒花基因组上的多态性来识别啤酒花品种的上述方法虽不受啤酒花的栽培环境、收获时期或保存方法的影响，为可准确识别啤酒花品种的有效手段，但因这些方法均需从PCR扩增的有无或大小的差异来进行识别，所以易受酶反应、电泳、凝胶染色等条件不统一的影响，在再现性上存在问题。即难于区别是因PCR、染色的不良好而未出现条带，或还是因为原本就未扩增，所以，具有错误判断结果的危险性。此外，上述方法因是通过毛细管电泳及激光的DNA片段检测、通过凝胶电泳的试样染色的检测等，所以，即使可特定作为被测物的啤酒花品种、甚至可推测有无不同品种混入，但还是难于推断或特定混入品种、分析混入品种的混入比例。而且，由于被测物的劣化、损伤等使DNA发生碎片化时，会降低分析精度，有错误判断结果的危险性。

作为极为有用且容易利用的多态性标记，单核苷酸多态性(以下也称为“SNP”。)受人注目。SNP(single nucleotide polymorphism)是基于1个碱基的不同的碱基序列的多态性。因SNP不受反应条件不统一的影响，所以，无疑似结果，易判断，且SNP数据可转换为(0，1)的数字信号来进行信息处理，所以，容易进行样品处理和数据分析的自动化，可使用庞大的SNP数据进行各种各样的分析。此外，用设计具有各种各样长度的非特异性Tail的引物等的方法，可一次性进行大量的SNP分析。

但是，啤酒花具有二倍体的20条(双链为10对)染色体，基因组大小为约27～30亿碱基对(2.7～3GB)，非常庞大，与结构基因的关联性尚不明确。因此，还未实施过从基因组分析的结果中找出可进行多品种识别程度的充分数量的啤酒花品种间SNP的工作，至今为止，将SNP用作多态性标记的啤酒花品种的识别方法还不为人所知。

现有技术文献

专利文献

专利文献1国际公开公报第WO1997/005281号公报