[发明专利]选择性核酸片段回收

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2012年6月1日提交的美国临时申请序列号61/689,221的优先权，这个临时申请以其全文引用的方式并入本文中。

技术领域

本发明涉及用于核酸纯化以及片段尺寸选择与回收的方法。

发明背景

许多分子生物学应用，如毛细管电泳、核苷酸测序，需要分离高质量的核酸制剂。质量是用于所有测序方法以及用于基因治疗方案的毛细管电泳的特别重要的因素。数量也是用于一些应用的同等重要的考虑因素，例如，大规模基因组作图和测序计划，其需要产生成千上万个高质量的DNA模板。

如下一代测序(Next Generation Sequencing；NGS)的新型技术的出现需要在DNA片段的某些群组的精确尺寸控制下的高质量的DNA样品制备。在DNA片段化或剪切之后，用于下一代测序的文库构建过程主要需要与平台无关的片段选择。片段选择后获得高回收率正成为用于减小测序偏差的重要的贡献因素。举例来说，为了制备用于Illumina NGS平台的DNA文库，在150-500bp范围内的DNA片段的回收对于较好的测序结果来说是关键的。其它NGS平台需要范围介于300-700bp之间的DNA片段。

存在两种常用方法来进行尺寸选择以用于NGS文库制备。一种方法是将片段化的DNA运行到琼脂糖凝胶中，然后切割具有所选的DNA尺寸的凝胶，然后从凝胶回收DNA片段。这种方法是精密的，但非常缓慢并且是劳动密集型的。

用来准备片段化的DNA的尺寸选择的另一种通常使用的方法是通过调节聚乙二醇(PEG)和盐的浓度使DNA结合于涂布有官能团(如羧基)的磁性小珠上。参看美国专利号6,534,262。这种方法有效地使DNA片段化并且可以在自动化平台中容易地适应以一次性处理大量样品。然而，当DNA片段大于400bp时，这种方法不会很好地工作以使DNA片段化。不需要的大DNA片段降低了后续NGS结果的数据质量并且浪费了仪器的能力。对于需要大DNA片段的NGS平台，例如用于Roche 454 Genome Sequencer的NGS平台，这种方法并不适合。

美国专利号5,234,809描述了一种使用固相粒子以在离液盐存在下特异性地和/或非特异性地结合来自样品的核酸的方法，这些离液盐如胍盐、碘化钠和碘化钾。然而，这种方法并未提供对核酸片段的任何尺寸控制。

因此，下一代测序(NGS)的不断增长的应用需要新的核酸纯化与片段尺寸选择方法，这些方法提供了高的核酸回收率和精确的片段尺寸控制。

发明概要

本发明提供了用于核酸纯化与片段尺寸选择的方法和试剂盒。在某些实施方案中，本发明提供了一种选择性地回收核酸片段的方法，其包括：a)将目标核酸与具有选定pH和盐浓度的结合缓冲液混合以允许具有所需尺寸范围的核酸片段结合到固体表面；b)将来自步骤a)的混合物施加到固体表面以使得只有具有所需尺寸范围的核酸片段可逆地并且非特异性地结合到固体表面；以及c)通过用洗脱缓冲液从固体表面洗脱结合的核酸片段来选择性地回收具有所需尺寸范围的结合的核酸片段。

在某些实施方案中，本发明方法中所用的结合缓冲液包含离液盐。离液盐的实例包括(但不限于)盐酸胍(GHCl)、硫氰酸胍(GITC)、碘化钠(NaI)和高氯酸钠，以及其混合物。在某些实施方案中，结合缓冲液的离液盐的浓度经过调节以使得只有具有所需尺寸范围的某些核酸片段能够可逆地并且非特异性地结合到固体表面，并且随后用洗脱缓冲液从固体表面洗脱。在某些实施方案中，盐酸胍(GHCl)或硫氰酸胍(GITC)的浓度介于0.8-5.0M之间；碘化钠(NaI)的浓度介于0.8-7.0M之间；并且高氯酸钠的浓度介于1.0-7.0M之间。在某些实施方案中，结合缓冲液中的离液盐浓度是通过用水稀释结合缓冲液来调节。

本发明提供了，通过调节结合缓冲液中的离液盐浓度，只有具有所需尺寸范围的某些核酸片段能够结合到固体表面，不需要的核酸片段与结合缓冲液一起保留在样品混合物中，并且在离心后被弃去。在某些实施方案中，固体表面包括(但不限于)二氧化硅膜滤柱或二氧化硅涂布的磁性微粒(小珠)。在某些实施方案中，核酸片段包括(但不限于)DNA片段、RNA片段或PNA片段。