[发明专利]用于检测和鉴定肠出血性大肠杆菌的方法

说明书

本发明涉及对人类健康构成严重风险的产志贺毒素的大肠杆菌(STEC)的鉴定。

产志贺毒素的大肠杆菌(STEC)是属于超过400种大肠杆菌O:H血清型的大肠杆菌的一个多元化群体，其中的一些引起从腹泻至出血性肠炎(HC)和溶血性尿毒综合征(HUS)范围的食源性疾病的爆发和偶发事件。根据它们的人类致病性，再后菌株也被称为肠出血性大肠杆菌(EHEC)(Levine 1987,Nataro and Kaper 1998)。HC和HUS的许多病例已经被归因于EHEC血清型O157:H7株，但现在已经认识到STEC的其它血清型属于EHEC群体。

因此，来自许多国家的累积证据表明，高达30-60％的人类STEC感染是由非O157 STEC引起的并且只有五至七种“优先级”STEC血清型与HC和HUS的爆发和偶发事件有关。这些包括血清型O26:[H11]、O45:[H2]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O145:[H28]、O157:[H7]以及它们的无运动性(non-motile)衍生物。此外，O104:[H4]的一株不寻常的菌株与2011年全球范围内HC和HUS的最大爆发有关(Scheutz et al.,2011；Frank et al.,2011；Struelens et al.,2011；Gault et al.,2011)。

因此，许多司法管辖区正在考虑实施食品检验计划(food inspection program)以保护公众免受这些对人类具有高毒力的STEC株的侵害。作为基于风险的食品检验计划的一部分，用于这些肠出血性大肠杆菌(EHEC)株的检测的理性方法需要优先级STEC的标志性特征的明确定义(例如血清群、血清型、毒力和其它标记)和在食品中检测这些致病性STEC的有效方法。非O157EHEC的检测尤其具有挑战性，因为它们没有特定特征将它们和共享同样生态位(niches)的大量无害共生大肠杆菌区分开。Karmali et al.(2003)提出了血清致病型分类，作为基于疾病的严重性、频率和与爆发的关联来鉴定参与食源性疾病爆发的最重要的O血清型的框架，但是各种STEC株之间的毒力差异的原因仍然不清楚。有可能这种差异是由于STEC株所具有的毒力基因谱的差异，需要研究以证实这一点并鉴定合适的分子标记。

已有技术通过例如检测stx1/stx2基因和定位于LEE(肠道细胞擦抹基因座，该基因座首次鉴定于肠致病性大肠杆菌(EPEC)中)上eae基因的存在，来测定样品中STEC污染的存在。但是STEC致病性的遗传基础比这些基因之一或二者的存在或不存在更加复杂得多。在复杂的样品(例如食品、粪便、环境样品)中可能包括菌株的混合物(例如STEC和EPEC株的混合)，stx1/2和eae基因的存在并不表示在该样品中存在EHEC。

然而，考虑到一些STEC株可引起人类非常严重的健康问题，在食品产品中检测到STEC株就会丢弃所述产品，即使可能该STEC不会对人类健康构成威胁。由于缺乏对非致病性STEC株和EHEC株的区分，这造成大量的浪费。

已经提出采用除stx1/2和eae标记外的其它遗传标记以选择性检测EHEC株并将它们与非致病性STEC株区分开。例如，PCT WO 2011/018762介绍了一种涉及基因stx1、stx2、eae、nleB和espK的组合检测以预测样品中EHEC的存在的方法。

但是，仍然需要可靠测试，用于区分性筛选包括非O157 EHEC的EHEC的存在，以及特异性检测EHEC血清型，尤其是在“排名前七位”血清型O26:[H11]、O45:[H2]、O103:[H2]、O111:[H8]、O121:[H19]、O145:[H28]、O157:[H7]中的EHEC血清型。

本发明人现在已经鉴定出了与构成人类健康严重风险的几种STEC株相关的区分性遗传标记。特别地，他们已经鉴定出了位于对人类具有高毒力的EHEC株的CRISPRs(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，成簇的、规律间隔的短回文重复序列)序列内的遗传标记。

CRISPRs存在于许多细菌种属(包括大肠杆菌)的基因组内。它们由含有21至47bp长度并由相似大小的间隔序列分开的直接重复序列的串联序列组成。间隔序列衍生自外源核酸，如噬菌体或质粒，并且已有假说称它们可以保护细菌免受随后由同源噬菌体和质粒带来的感染。