[发明专利]用于制备抗体缀合物的新方法以及新的抗体缀合物

说明书

本发明涉及用于制备抗体缀合物的新方法，以及新的抗体缀合物。

抗体对靶细胞和分子表面上的特定抗原的特异性已经使得它们被广泛用作各种诊断和治疗试剂的载体。例如，与标记物和报告基团(如荧光团、放射性同位素和酶)缀合的抗体可用于标记和成像应用，而与细胞毒性试剂和化疗药物的缀合使得能够将这类试剂靶向递送到特定的组织或结构(例如，特定的细胞类型或生长因子)，将对正常、健康组织的影响最小化并显著降低与化学疗法治疗相关的副作用。抗体-药物缀合物在一些疾病领域——特别是在癌症中——具有广泛的潜在的治疗应用。

之前将所需部分与抗体缀合的方法通常包括在整个抗体的位点上的非特异缀合(例如，经由赖氨酸侧链氨基)，导致缀合产物的不均匀分布并经常导致未缀合的蛋白，从而得到其表征和纯化都很困难且昂贵的复杂混合物。这种混合物中的每种缀合产物都可能具有不同的药物代谢动力学、分布、毒性和效力特性，并且非特异性缀合还经常导致抗体功能受损。

抗体的缀合还可以经由半胱氨酸巯基基团进行，所述半胱氨酸巯基基团是通过还原链间二硫键，接着通过采用待连接部分对每个游离半胱氨酸残基的烷基化而活化的。在具有四个链间二硫键的IgG1单克隆抗体中，这种位点特异性缀合导致连接有最高达八个活性部分的缀合物。但是，这种缀合方法仍然产生具有可变的化学计量(每个抗体0、2、4、6或8个部分)以及所连接的部分分布在所述八个可能缀合位点上的缀合物的异质混合物。另外，在与这些不同半胱氨酸残基缀合的过程中，原来的二硫键不能总是被再次桥接，可能导致结构改变和抗体功能受损。

每个抗体上所缀合的部分的数目相同以及每个部分特异性地缀合到每个抗体中相同的氨基酸残基上，这对于获得最佳效能和确保剂量间一致性来说是重要的。因此，已经开发了很多方法来提高抗体缀合物的同质性。

WO 2006/065533认识到可通过将抗体的载药化学计量降低到低于8个药物分子/抗体来改善抗体-药物缀合物的治疗指数，并且公开了具有用于化学计量药物连接的预定位点的改造抗体(engineered antibody)。参与链间二硫键形成的亲本抗体(parent antibody)的8个半胱氨酸残基均被另一种氨基酸残基系统地替换以产生具有6、4或2个剩余的可用半胱氨酸残基的抗体变体。接着将具有4个剩余半胱氨酸残基的抗体变体用于产生显示确定的化学计量(4个药物/抗体)和药物连接位点的缀合物，该缀合物显示了与先前的方法得到的更加异质的“部分加载的”4个药物/抗体的缀合物相似的抗原结合亲和力和细胞毒性活性。

虽然WO 2006/065533的抗体产生了具有提高的产率的同质缀合物，但认为天然链间二硫键的消除会破坏抗体的四级结构，从而扰乱抗体的体内行为，包括抗体效应子功能的改变(Junutula JR,et al.Nat Biotechnol.2008Aug；26(8):925-32)。

WO 2008/141044涉及抗体变体，其中所述抗体的一个或多个氨基酸被半胱氨酸氨基酸置换。所述改造的半胱氨酸氨基酸残基是游离的氨基酸且不是链内或链间二硫键的一部分，使得能够以确定的化学计量缀合药物且不会破坏天然二硫键。然而，仍然有这样的风险，即将游离半胱氨酸残基改造到抗体分子中可能在抗体折叠和组装过程中引起与分子中存在的半胱氨酸残基的重排和错配反应(scrambling reaction)，或通过与另一抗体分子中的游离半胱氨酸残基反应而导致二聚化，造成抗体功能受损或聚集。

WO 2005/007197描述了用于使聚合物与蛋白质缀合的方法，其使用具有与来自蛋白质中的二硫键的两个硫原子缀合的新的缀合试剂以产生新的硫醚缀合物的能力的新缀合试剂。在该方法中，将二硫键还原以产生两个游离的半胱氨酸残基，接着使用与聚合物共价连接的桥接试剂重新形成二硫键，而不破坏蛋白质的三级结构或消除其生物活性。然而，由于抗体分子铰链区中相邻二硫键比较接近会导致一些二硫键错配(scrambling)，因此，与用于其它蛋白质时相比，该方法用于缀合抗体时可能是较低效的。

现在本发明人已发现所述方法的一种变化形式，其在制备抗体缀合物的过程中降低二硫键错配的问题并提高抗体缀合物的同质性。

因此，本发明提供用于制备抗体缀合物的方法，包括以下步骤：使具有单个重链间二硫键的改造抗体与缀合试剂反应，所述缀合试剂在来自二硫键的两个半胱氨酸残基之间形成桥接(bridge)。