[发明专利]减少糖蛋白聚集的方法

说明书

本发明提供了通过优化O‑连接的糖基化位点的数量，减少糖蛋白聚集的方法。

本申请全文中参考了多种出版物。这些出版物的公开内容以其整体通过引用并入本申请，以更完整地描述本发明所涉及的现有技术的状态。

发明领域

本发明涉及通过优化O-连接的糖基化位点的数量，减少糖蛋白聚集的方法。

发明背景

蛋白糖基化是决定生物制剂的功效和药代动力学长效的重要质量属性。理解每个糖基化位点如何影响蛋白质的整体功能有助于优化最终产品质量。通过达到均质的糖基化谱，可实现产量的增加并确保产品的可比性。

O-连接的糖基化是指将N-乙酰半乳糖胺、半乳糖，或木糖中的一种糖连接到羟基氨基酸，最通常是丝氨酸或苏氨酸。O-连接的糖残基具有的结构规则少于N-连接的糖基化，并且因此产生更大的糖型多样性。由于缺少共有的识别序列，O-连接糖基化是难以预测的。然而，已开发出神经网络方法以更好地预测粘蛋白型O-连接的位点(Julenius, K等人，2005. Glycobiology 15, 153-164)。尽管迄今为止的大多数报道记载了O-多糖在糖蛋白结合能力或掩蔽其肽骨架中的作用，一个具体案例研究证实了具有更多O-连接的位点的促卵泡激素(FSH)类似物的生物活性低于具有更多N-连接的糖基化位点的FSH类似物(Weenen, C.等人，2004. J Clin Endocrinol Metab 89, 5204-5212)。已经显示O-连接的多糖对于糖蛋白gC-1的细胞表面表达是非必需的，但可干扰其表位的结合结构域及其结合能力(Biller, M.等人，2000. Glycobiology 10, 1259-1269)。

认为糖基化的存在影响商业生物制剂的免疫原性、功效、溶解度和半衰期(Lis,H.等人，1993. Eur J Biochem 218, 1-27；Lowe, J.B.等人，2003. Annu Rev Biochem72, 643-691；Van den Steen, P.等人，1998. Crit Rev Biochem Mol Biol 33, 151-208)。然而，大多数文献集中于N-连接糖基化的影响(Hossler, P.等人，2009.Glycobiology 19, 936-949)。缺乏关于O-连接的糖基化对蛋白质量的影响的信息，特别是关于蛋白聚集的信息。

蛋白治疗剂在制造期间的聚集是不期望的，并且需要密集的下游加工以将其去除。因此，需要使蛋白聚集最小化，导致生产成本降低和加速的工艺过程优化。O-连接的糖基化与治疗性糖蛋白的聚集之间的关系的发现使得制造者能够在产品开发早期改进所述治疗性糖蛋白。

发明内容

本发明提供了通过优化O-连接的糖基化位点的数量，减少糖蛋白聚集的方法。所述糖蛋白可以是融合蛋白。所述融合蛋白可包含人免疫球蛋白的Fc区的铰链部分。所述人免疫球蛋白可以是人IgG。

本发明提供了减少糖蛋白聚集的方法，其包括消除其中一个或多个O-连接的糖基化位点。待消除的O-连接的糖基化位点可以在Fc结构域的铰链区中。

本发明提供了减少糖蛋白聚集的方法，其包括通过氨基酸取代和/或删除消除一个或多个O-连接的糖基化位点。所述一个或多个取代和/或删除的O-连接的糖基化位点可以在SEQ ID NO:5中所示的Fc结构域的铰链区中。在SEQ ID NO:5中所示的Fc结构域的铰链区中的可消除的O-连接的糖基化位点选自S248、T252、T254。所述一个或多个取代和/或删除的O-连接的糖基化位点可以在SEQ ID NO:4中所示的突变的Fc结构域的铰链区中。在SEQID NO:4中所示的Fc结构域的铰链区中的可消除的O-连接的糖基化位点选自S129、S130、S136、S139、T133、T135。