[发明专利]用于结合有机靶的没有重复片段的蜘蛛丝融合蛋白结构

说明书

发明的技术领域

本发明涉及重组融合蛋白的领域，且更具体地涉及包括衍生自蜘蛛丝蛋白(拖丝蛋白)的部分的新颖融合蛋白。本发明提供了用于提供为包括重组融合蛋白的聚合物的蛋白结构的方法，所述重组融合蛋白包括衍生自拖丝蛋白的部分。还提供了用于结合有机靶的新颖蛋白结构。

发明背景

在应用蛋白化学中，一个常见的问题是如何向相关的活性位点配制或呈现生物活性肽或蛋白，所述活性位点通常是有机靶，诸如核酸、蛋白、蛋白复合体、蛋白和/或脂质和/或碳水化合物和/或核酸的复合体。最简单的解决方案是仅仅提供生物活性肽或蛋白的水溶液。然而，许多应用的确要求一些进一步的手段来实现期望的目标。例如，可将肽/蛋白缔合于脂质混合物或化学地固定于支持结构。

用于固定于支持结构的肽/蛋白的应用包括制备和分析性分离程序诸如生物工艺、层析法、细胞捕获和培养、主动过滤器(active filters)和诊断学。基于胞外基质蛋白例如胶原的结构公开在EP 704 532和EP 985 732中。

还已经建议在支持结构中使用蜘蛛丝蛋白。蜘蛛丝是天然的高性能聚合物，由于强度和弹性的组合而获得了非同寻常的韧性和延伸性。蜘蛛具有多达七个不同的腺，这些腺产生具有不同机械性质和功能的多种丝类型。由大壶状腺产生的拖丝(dragline silk)是最坚韧的纤维。它由两种主要的多肽组成，大多被称为大壶状腺拖丝蛋白(spidroin)(MaSp)1和2，但在例如，在十字园蛛(Araneus diadematus)中被称为ADF-3和ADF-4。这些蛋白质具有200-720 kDa范围内的分子量。蜘蛛拖丝蛋白质或MaSp具有分成三部分的组成：无重复的N-端结构域、由许多重复的聚Ala/Gly区段构成的中心重复区域和无重复的C-端结构域。通常认为重复区域在丝纤维中形成分子间接触，但不太清楚末端结构域的准确功能。还认为与纤维形成相联系地，重复区域经历从无规卷曲和α-螺旋构象到β-折叠结构的结构转化。拖丝蛋白的C端区域在蜘蛛种类和丝类型之间通常是保守的。

WO 07/078239和Stark,M.等人,Biomacromolecules 8:1695-1701,(2007)公开了由具有高的Ala和Gly含量的重复片段和蛋白质的C端片段组成的微型蜘蛛丝蛋白，以及包含蜘蛛丝蛋白的可溶性融合蛋白。在蜘蛛丝蛋白从其融合配体释放后，自然地获得蜘蛛丝蛋白的纤维。

Rising,A.等人,CMLS 68(2):169-184(2010)综述了在产生蜘蛛丝蛋白方面的进展。纤维产生自微型化的拖丝蛋白构建体，所述微型化的拖丝蛋白构建体由衍生自蜘蛛丝蛋白的重复区的区段的4个重复和非重复C端结构域构成。

US 2009/0263430公开了酶β-半乳糖苷酶与微型蜘蛛丝蛋白的膜的化学偶联。然而，化学偶联可能要求对蛋白稳定性和/或功能不利的条件。包含衍生自蜘蛛丝蛋白的重复区的区段的多个重复的蛋白已经被设计以包括RGD细胞结合区段(Bini,E等人,Biomacromolecules 7:3139-3145(2006)；Morgan等人，Biomaterials 29(16):2556-2563(2008))和/或R5肽(Wong Po Foo,C等人,Proc Natl Acad Sci 103(25):9428-9433(2006))或参与矿化作用(mineralization)的其它蛋白区段(Huang,J等人,Biomaterials 28:2358-2367(2007)；WO 2006/076711)。在这些现有技术文献中，通过在变性的有机溶剂六氟异丙醇(HFIP)中增溶融合蛋白和干燥来形成膜。

US 2005/261479 A1公开了用于纯化由重复片段和亲和性标签组成的重组丝蛋白的方法，包括从复杂混合物中磁亲和性分离单独的丝蛋白，而不形成丝蛋白纤维或其它聚合物结构。

已知的支持结构和相关的技术在以下方面具有某些缺陷，例如经济性、效率、稳定性、再生能力、生物活性和生物相容性。

发明概要

本发明的一个目的是提供新颖的重组融合蛋白。特别是，本发明的一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的新颖的重组融合蛋白。

本发明的一个目的是提供能够与有机靶选择性相互作用的新颖蛋白结构。