[发明专利]5’保护依赖性扩增

说明书

本发明涉及从包含5’保护基团的RNA产生标记的核酸的方法，所述方法包含以下步骤：获得核酸模板链的混合物，所述混合物包含所述RNA以及进一步潜在的其他无5’保护基团的核酸，将至少一种寡核苷酸引物与所述RNA以及潜在的其他核酸的模板链退火，并且模板序列依赖地延伸所述引物，从而获得与其模板链退火的互补核酸链，或提供位于具有与其模板链退火的互补核酸链的双链中的RNA，和任选地修饰在模板链的5’端或互补链的3’端或两者上无5’保护基团的所述核酸的延伸产物，和标记未被修饰的双链核酸的互补核酸，其中由此标记的核酸具有RNA模板链上的5’保护基团，所述5’保护基团在修饰后被任选地移除，和/或基于互补核酸模板RNA链上5’保护基团的存在，通过双链依赖的连接标记双链的互补核酸，由此特异性地产生与至少原来包含5’保护基团的RNA互补的标记的核酸。

技术领域

本发明涉及分析复杂的核酸混合物的领域，尤其是对在核酸5’区域提供不同核苷酸的核酸的分析和选择，特别是对RNA，尤其是加帽RNA例如信使RNA(mRNA)的纯化，以及对衍生自该RNA的cDNA拷贝的富集。

背景技术

核酸，例如总RNA提取物能在其5’端提供不同的化学结构。例如28S和18S核糖体RNA(rRNA)以及微RNA(miRNA)和5’降解RNA具有5’单磷酸。其他RNA具有5’二磷酸例如5SrRNA中间体或5’OH例如18S rRNA中间体和转移RNA(tRNA)中间体。原核生物mRNA具有5’三磷酸，真核生物mRNA具有帽子结构。帽子结构本质上是鸟苷，其嘌呤环的N7上被甲基化，其5’位置与RNA临近核苷酸的5’位置通过三磷酸桥连接。

由于RNA 5’核苷酸的5’位置上的不同化学结构提供关于该RNA功能及合成和降解途径的信息，选择具有不同5’端的RNA的方法是RNA分析的重要工具。

另外，由于存在如PCR等许多DNA分析的强有力的方法，RNA被逆转录成cDNA以进行许多下游分析。因此，最期待的是特定RNA 5’端的同一性信息被转换成cDNA，同时该cDNA是该RNA尽可能真实的拷贝。这对RNA分子的全长分析尤其重要，因为只有全长RNA分子显示RNA的整体序列同一性。

有几种能够选择不同类别RNA的方法。例如，真核生物mRNA经常基于帽子结构和/或3’多聚腺苷酸(poly A)尾进行选择。针对多聚腺苷酸尾的富集方法，例如寡脱氧胸苷(oligo dT)柱层析是本领域熟知的。在第一链cDNA合成期间的寡脱氧胸苷匹配是在逆转录期间复制mRNA的另一种方法。然而，选择多聚腺苷酸尾的方法不针对5’降解的或片段化mRNA，以及某些不进行多聚腺苷酸化的RNA类别例如组蛋白mRNA进行选择。

因此，又开发出利用帽子结构的存在纯化或富集mRNA或其cDNA的方法。

例如，寡核苷酸加帽(2-4)是一种用于在mRNA 5’端添加寡核苷酸的方法。该方法具有多个步骤，要求RNA样品去磷酸化，仅留下5’OH和帽子结构。然后所述帽被烟草酸性磷酸酶(TAP)切割掉，留下5’单磷酸，所述5’单磷酸继而可用于将寡核苷酸与该5’单磷酸连接的后续反应。本质上该寡核苷酸提供例如经PCR扩增的逆转录后能被选择的序列标签。利用寡核苷酸加帽方法联合对全长扩增产物的选择(例如WO 2007/062445中所述)，本发明人发现，由于所用的降解长RNA分子的多个酶促步骤，寡核苷酸加帽向较短RNA分子引入大量偏差。因此，期待有在扩增和帽子结构选择期间保留RNA或其全长序列信息的方法。

帽陷阱(cap trapper)法(5；6)是选择mRNA序列的另一种方法，首先生物素标记该帽，然后逆转录该RNA。在进一步的步骤中，RNAse I被用于水解所有不存在于与cDNA的杂种(hybrid)中的RNA。然后mRNA/cDNA杂种被结合至磁性抗生物素蛋白珠，有效选择继而被进一步处理的全长cDNA拷贝。

一个类似的方法是CAPture(7)，EP 373 914 A2使用与固相载体缀合的帽结合蛋白(真核起始因子4)，与RNAse I消化步骤联合用于选择mRNA/cDNA杂种。