[发明专利]人胚胎干细胞衍生的间充质样干细胞、方法及其应用

权利要求书

1.一种从人胚胎干细胞(hESCs)或诱导多能干细胞(iPSCs)生产滋养层来源的间充质干细胞(T-MSCs)的方法，所述方法包括：

(a)在包含骨形态发生蛋白4(BMP4)的培养基中培养hESCs或iPSCs2-5天，足以使hESCs或iPSCs分化成滋养层；

(b)把滋养层细胞分散成单细胞；

(c)将所述滋养层细胞重新铺在包被明胶、玻连蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白、基质胶或胶原的板上；以及

(d)在包含20％FBS和非必需氨基酸的α-MEM的间充质干细胞(MSC)生长培养基中培养所述滋养层细胞4-10天，所述培养基的量足够诱导所述滋养层细胞分化成间充质干细胞，其中至少90％所述间充质干细胞表达CD73；所述方法产生1×10⁶至5×10¹⁰间充质干细胞。

2.权利要求1所述的方法，其中，步骤(d)培养所述滋养层细胞是6天至8天。

3.权利要求1所述的方法，其中，步骤(a)中所述培养基进一步包含TGFβ抑制剂以提高分化效率。

4.权利要求3所述的方法，其中，所述TGFβ抑制剂是SB431542或A83-01抑制剂。

5.权利要求3所述的方法，其中，所述TGFβ抑制剂是ALK5抑制剂。

6.权利要求1所述的方法，其中，在步骤(a)之前，hESCs培养包括以下步骤：

(i)在基质胶包被的培养板上培养至80％汇合度；

(ii)分散细胞；

(iii)分离；和

(iv)清洗。

7.权利要求1所述的方法，其中，所述BMP4的浓度是1ng/ml至100ng/ml。

8.权利要求1所述的方法，其中，所述BMP4的浓度是2ng/ml至100ng/ml。

9.权利要求1所述的方法，其中，所述BMP4的浓度是1ng/ml至10ng/ml。

10.权利要求4所述的方法，其中，所述A83-01的浓度是0.1μM至5μM。

11.权利要求4所述的方法，其中，所述SB431542的浓度是1μM至20μM。

12.权利要求1至11中任一项所述的方法，其中，所述的间充质干细胞是CD105⁺和/或CD90⁺，并且纯度至少90％。

13.滋养层来源的间充质干细胞，其通过权利要求1～12任一项所述的方法生产。

14.权利要求13所述的间充质干细胞，其中，所述细胞至少95％是CD73⁺。

15.权利要求13或14所述的间充质干细胞，其中，所述细胞是>98％CD73⁺，>95％CD90⁺，>90％CD105⁺，>95％CD44⁺和/或>80％CD29⁺。

16.权利要求13或14所述的间充质干细胞，其中，所述细胞是内皮标记CD31阴性和造血标记CD34阴性。

17.权利要求15所述的间充质干细胞，其中，所述细胞是内皮标记CD31阴性和造血标记CD34阴性。

18.权利要求13～17任一项所述的间充质干细胞在产生脂肪细胞、软骨细胞、成骨细胞、神经细胞谱系细胞、成肌细胞、基质细胞或成纤维细胞中的用途。